2.2.1.Hoàn thiện công thức bào chế miếng dán và bước đầu thẩm định quy trình
sản xuất ở quy mô 1000 miếng
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất tăng thấm đến khả năng thấm của dược chất. - Công thức tối ưu tại phòng thí nghiệm.
- Quy trình tối ưu tại phòng thí nghiệm.
- Bước đầu sản xuất thử nghiệm và thẩm định quy trình sản xuất ở quy mô 1000 miếng.
2.2.2.Đề xuất xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho miếng dán tối ưu
2.2.3.Đánh giá tính kích ứng và tác dụng dược lý của miếng dán một lớp chứa capsaicin 0,025% capsaicin 0,025%
- Đánh giá tính kích ứng trên da thỏ.
- Đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau trên chuột.
2.3.Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.Phương pháp bào chế miếng dán
Quy trình:
- Bột Viscomate NP-700 và nhôm hydroxyd dạng gel khô được trộn đều và phân tán vào glycerin bằng máy khuấy từ, với tốc độ 200 vòng/phút, đến khi đồng nhất.
- Hòa tan acid tartaric vào nước, rồi phối hợp dung dịch này vào hỗn dịch glycerin, tiếp tục khuấy trộn bằng khuấy từ, Viscomate gặp nước trương nở tạo gel.
- Hòa tan cao ớt vào dung môi thích hợp rồi phối hợp vào khối gel cho đến khi đồng nhất.
- Cán mỏng khối gel lên lớp bảo vệ bằng dụng cụ cán phim cầm tay ở độ dày 500 µm, cán tiếp lớp đế lên trên và để ổn định trong 48 giờ.
18
2.3.2.Phương pháp đánh giá miếng dán
2.3.2.1. Phương pháp định lượng capsaicin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tham khảo Dược điển Mỹ USP 41, Dược điển châu Âu 8.0 cùng một số tài liệu [32], [21], [52] tiến hành định lượng capsaicin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện:
- Pha động: acetonitril và dung dịch acid phosphoric 1 g/l (40:60, tt/tt)
- Pha tĩnh: cột phenylhexyl (chiều dài 25 cm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm)
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Nhiệt độ: 30oC
- Thể tích tiêm: 20 µl
- Detector huỳnh quang, với bước sóng kích thích và phát xạ lần lượt là 280 và 310 nm.
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn Capsaicin Fluca (61,1% capsaicin), hòa tan bằng methanol. Chuyển dung dịch vào bình định mức 10,0 ml, thêm methanol đến vạch, được dung dịch chuẩn gốc nồng độ capsaicin khoảng 15 mg/ml (S).
Dãy dung dịch chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc 50 lần được dung dịch chuẩn 30 µg/ml (S1). Pha loãng dung dịch S1 bằng methanol lần lượt 2, 5, 6, 10 và 20 lần được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 15 (S2), 6 (S3), 5 (S4), 3 (S5) và 1,5 (S6) µg/ml. Pha loãng dung dịch S6 10 lần được dung dịch S7 nồng độ 0,15 µg/ml.
Dung dịch thử: Cắt miếng dán có kích thước 2 x 2 cm. Bóc lớp bảo vệ và ngâm miếng dán với khoảng 7 ml methanol trong 24 giờ rồi siêu âm 15 phút. Dung dịch sau siêu âm đem ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút - trong 10 phút rồi chuyển vào bình định mức 10,0 ml. Thêm methanol tới vạch, lắc đều được dung dịch thử.
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất của miếng dán
Tham khảo tài liệu [3], [51], [52] tiến hành đánh giá khả năng giải phóng dược chất của miếng dán với điều kiện như sau:
- Thiết bị: Thiết bị khuếch tán Franz (thể tích 7 ml, diện tích khuếch tán 1,767 cm2) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Môi trường: đệm phosphat 7,4 và ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 1:1, tt/tt) - Tốc độ khuấy từ: 600 vòng/phút
19
- Nhiệt độ: 32 ± 0,5oC Cách tiến hành:
Sau khi lấp đầy ngăn nhận bằng môi trường, đặt màng thẩm tích (12 – 14 kDa) phủ kín diện tích khuếch tán bình Franz. Tiến hành cắt miếng dán kích thước 2 x 2 cm, bỏ lớp bảo vệ, đặt lên trên màng thẩm tích, đảm bảo phủ kín diện tích khuếch tán. Tại các thời điểm 2, 4, 6, 8 và 24 giờ, lấy chính xác 0,5 ml môi trường ngăn nhận đem định lượng bằng HPLC, bổ sung bằng đồng lượng môi trường mới.
Lượng capsaicin giải phóng qua màng thẩm tích được xác định theo công thức: Xt = 𝐶𝑐
𝑆𝑐 x 1
𝑆𝑚 x (V1 x Sk + V2 x ∑𝑘𝑡=2𝑆t-1) Trong đó:
- Xt là lượng capsaicin giải phóng qua 1 đơn vị diện tích (μg/cm2)
- Sc, Sk (k là thứ tự các thời điểm lấy mẫu, k = 1, 2, 3, 4, 5) lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử tại các thời điểm 2, 4, 6, 8 và 24 giờ (LU.s)
- Cc là nồng độ dung dịch chuẩn (μg/ml)
- V1 là thể tích môi trường có trong ngăn nhận (ml) - V2 là thể tích môi trường lấy tại các thời điểm t (ml) - Sm là diện tích màng thẩm tích đem thử giải phóng (cm2)
Vẽ đồ thị lượng dược chất giải phóng thẩm tích theo thời gian. Thông lượng khuếch tán J (μg.cm-2.h-1) được xác định bằng cách hồi quy tuyến tính Xt sau khi giải phóng đạt đến cân bằng.
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng thấm dược chất qua da chuột của miếng dán
Chuột nhắt trắng được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 20 ± 3°C và độ ẩm 50 – 60%, với đủ thức ăn và nước uống. 24 giờ trước thí nghiệm, gây tử vong bằng cách làm trật khớp xương sống chuột. Sau đó, loại bỏ lông chuột, lấy phần da lưng và loại bỏ lớp mỡ dưới da. Bảo quản da trong điều kiện 2-8oC. Hoạt hóa lại da bằng nước muối sinh lí ở nhiệt độ 32oC trong 10 phút trước thí nghiệm.
Tiến hành theo điều kiện tương tự đánh giá khả năng giải phóng qua màng thẩm tích. Mẫu ngăn nhận được lấy tại các thời điểm 2, 4, 6, 8 và 24 giờ, định lượng bằng HPLC. Xác định thông lượng J bằng hồi quy tuyến tính lượng capsaicin thấm qua da cho đến khi đạt cân bằng.
20
2.3.2.4. Phương pháp đánh giá tính dính của miếng dán
Mẫu thử được bảo quản trong phòng có nhiệt độ 25 ± 20C từ 30 phút trở lên. Đặt mẫu thử vào vị trí cuối cùng trên đường lăn của bi thép trên dụng cụ đo, mặt dính ngửa lên trên.
Dùng bi thử số 15 (ϕ = 11,1 mm; m = 5,6 g) làm bằng thép không gỉ, thả bi từ trên đỉnh thiết bị, bi lăn xuống tiếp xúc với mẫu thử lăn trên mặt dính đến khi dừng lại.
Độ dính được xác định bằng khoảng cách từ điểm bi tiếp xúc với mặt dính đến điểm bi dừng (điểm dừng của bi). Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 6 lần đo.
Yêu cầu: Giá trị trung bình không được lớn hơn 45 mm.
2.3.3.Phương pháp sử dụng ATR-FTIR trong đánh giá tương tác của chất tăng
thấm tới cấu trúc da
Tham khảo tài liệu [37] tiến hành thí nghiệm đánh giá tương tác của chất tăng thấm tới cấu trúc da như sau:
Chuẩn bị da chuột: Chuột nhắt trắng được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 20 ± 3˚C và độ ẩm 50-60%. 24h trước thí nghiệm, gây tử vọng bằng cách làm trật khớp xương sống chuột. Loại bỏ lông chuột, lấy phần da lưng và loại bỏ lớp mỡ dưới da. Bảo quản da trong điều kiện <0˚C (có thể giữ da chuột trong 1 tuần). Trước thử nghiệm, da được hoạt hóa bằng NaCl 0,9% ở 37oC sau đó lau bằng bông. Các chất tăng thấm và capsaicin hòa tan trong chất tăng thấm được thêm vào da. Sau 24h bề mặt da được lau bằng bông. Tiến hành đo phổ ATR-FTIR của các mẫu tại dải sóng từ 4000 – 400 cm-1 bằng thiết bị Thermo Nicolet IS50 của Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). Phần mềm OMNIC 9.8 được sử dụng để ghi phổ và phần mềm TQ Analyst 9.8 của Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) được sử dụng để xử lý quang phổ.
- Tiến hành trên 5 mẫu:
+ Mẫu 1: Da chuột (mẫu trắng)
+ Mẫu 2: Da chuột + N-methyl pyrrolidon + Mẫu 3: Da chuột + Transcutol
+ Mẫu 4: Da chuột + Capsaicin/ N-methyl pyrrolidon (5%) + Mẫu 5: Da chuột + Capsaicin/Transcutol (5%)
2.3.4.Phương pháp đánh giá khả năng hydrat hóa trên da (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
21
2.3.4.1. Chuẩn bị
Chuột cống trắng, giống đực khỏe mạnh có khối lượng từ 250 - 300 g, được chuyển tới phòng nuôi nhốt và cho ăn uống đầy đủ trong 1 tuần. Sau đó, lưng chuột được cạo sạch lông bằng tông đơ 24 giờ trước thí nghiệm.
2.3.3.2. Thiết kế thí nghiệm:
Chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm:
- Nhóm 1 (chứng): Chuột bình thường không bôi chế phẩm - Nhóm 2: Chuột được bôi gel capsaicin
- Nhóm 3: Chuột được bôi gel capsaicin có chứa N-methyl pyrrolidon - Nhóm 4: Chuột được bôi gel capsaicin có chứa Transcutol
Lượng chính xác 0,5 g mỗi mẫu được bôi đều lên diện tích 2,5 x 2,5 cm2 trên phần lưng đã cạo lông, sau đó dùng gạc và băng dính y tế che lên vị trí bôi để giảm thiểu quá trình bay hơi. Chuột được cho ăn uống bình thường trong quá trình làm thí nghiệm. Sau 24 giờ, tách riêng phần da đã bôi thuốc và cố định mẫu trong lượng dung dịch formalin 10% lớn hơn lượng mẫu ít nhất 10 lần và trong ít nhất 24 giờ. Tiến hành vùi bệnh phẩm trong parafin trong 16 giờ sau đó cắt mảnh cắt vi thể bằng máy THERMO HM 325. Tiếp tục tiến hành nhuộm hematoxylin - eosin rồi soi trên kính hiển vi quang học.
Quá trình xử lý mẫu và cắt nhuộm được tiến hành tại phòng xét nghiệm của bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Mẫu mô được đo ở vật kính 40 trên kính hiển vi Olympus 8G52445.
Cách tiến hành đo bề dày lớp sừng:
+ Đặt mẫu đã được xử lý lên lam kính và hiêu chỉnh thiết bị để tiến hành quan sát.
+ Mẫu da được quan sát và chụp lại.
+ Quan sát và đo độ dày của lớp ngoài cùng màu đậm theo tỉ lệ của vật kính quan sát.
2.3.5.Phương pháp đánh giá tính kích ứng da của chế phẩm
Tham khảo tài liệu [22], [29] kết hợp với sự phù hợp phòng thí nghiệm, quá trình đánh giá khả năng gây kích ứng của miếng dán CAP trên da thỏ thực hiện như sau:
22
Sử dụng thỏ trắng trưởng thành, đực hoặc cái (không sử dụng thỏ có thai hoặc đang cho con bú), khoẻ mạnh, cân nặng không dưới 2 kg. Thỏ được nhốt riêng từng con, nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thử.
Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhiệt độ phòng 25 ± 30C, độ ẩm tương đối 30-70%, ánh sáng đảm bảo 12 giờ tối, 12 giờ sáng hàng ngày.
- Chuẩn bị mẫu
Mẫu thử là các miếng dán giảm đau đạt tiêu chuẩn đã xây dựng. Mẫu chứng là miếng dán placebo không chứa cao ớt.
- Tiến hành
Trước ngày thí nghiệm, làm sạch lông thỏ ở vùng lưng đều về hai bên cột sống một khoảng đủ rộng để đặt các mẫu thử và đối chứng (10 x 15 cm). Chỉ những thỏ có da khoẻ mạnh, đồng đều và lành lặn mới được dùng vào thí nghiệm.
Mỗi mẫu được thử trên 06 thỏ.
Sơ đồ đặt mẫu thử có thể bố trí như trong hình PL 2. - Quan sát và ghi điểm
Quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da dán mẫu thử, mẫu chứng với da không dán ở các thời điểm 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ. Có thể kéo dài hơn thời gian quan sát khi có tổn thương sâu để có thể đánh giá đầy đủ hơn về khả năng hồi phục hoặc không hồi phục của vết thương nhưng không nên quá 14 ngày.
- Đánh giá kết quả
Trên mỗi thỏ, điểm phản ứng được tính bằng tổng số điểm ở hai mức độ ban đỏ và phù nề chia cho số lần quan sát. Điểm kích ứng của mẫu thử được lấy trung bình điểm phản ứng của các thỏ đã thử.
Đối chiếu điểm kích ứng với các mức độ qui định trên bảng PL 1 để xác định khả năng gây kích ứng trên da thỏ của mẫu thử.
Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo qui định ở bảng PL 2.
23 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.6.Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau trên mô hình in vitro
và trên động vật thí nghiệm
2.3.6.1. Thiết kế nghiên cứu a. Đối tượng nghiên cứu
Chuột cống trắng trưởng thành (150 – 180 g) do Trung tâm Động vật thí nghiệm, Học viện Quân y, được cho ăn uống và nuôi ở nhiệt độ 25 ± 1oC, nhịp ngày đêm là 12h/12h. Chuột được nuôi trong thời gian bảy ngày để thích nghi trước khi tiến hành bất kỳ thao tác thí nghiệm nào.
b. Phương pháp gây viêm và sử dụng miếng dán điều trị
Chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm:
- Nhóm 1(chứng sinh lý): tiêm dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%, không điều trị.
- Nhóm 2 (chứng bệnh lý): gây viêm, không điều trị.
- Nhóm 3 (chứng dương): gây viêm, điều trị bằng miếng dán Wellpatch, 2 lần/ngày, trước khi gây viêm 2 ngày và trong suốt quá trình thí nghiệm.
- Nhóm 4 (placebo): gây viêm, điều trị bằng miếng dán chỉ chứa tá dược, không chứa cao mềm định chuẩn ớt, được dán 2 lần/ngày, trước khi gây viêm 2 ngày và trong suốt quá trình thí nghiệm.
- Nhóm 5(nhóm điều trị): gây viêm, điều trị bằng miếng dán capsaicin 0,025%, được dán 2 lần/ngày, trước khi gây viêm 2 ngày và trong suốt quá trình thí nghiệm.
Chuột được tiêm 0,1 ml carrageenan 1% trong nước muối sinh lý vào bàn chân sau bên phải để gây viêm [35]. Miếng dán kích thước 1 x 1 cm được sử dụng dán lên gan bàn chân chuột. Trong khi đó, các động vật nhóm 1 chỉ được dùng nước muối sinh lý thông thường và được coi là đối chứng bình thường.
Hình 2.1. Hình ảnh chân (P) chuột sưng viêm sau tiêm dung dịch carrageenan 1% 3 ngày
24
2.3.6.2. Phương pháp đánh giá mức độ viêm và đau
Tham khảo tài liệu [14], [28] tiến hành đánh giá mức độ viêm và đau.
a. Đánh giá mức thay đổi thể tích chân chuột
Chuột khi bị viêm chân sẽ sưng to lên (thể tích chân tăng lên), mức độ sưng tương ứng với mức độ viêm. Do đó đánh giá thể tích chân chuột sẽ giúp ta xác định được mức độ viêm.
Cách xác định: Thể tích chân sau của chuột ở hai bên (cùng bên và đối bên gây viêm) được đo bằng phương pháp đo sự thay đổi thể tích nước sử dụng Plethysmometer (Ugo Basile), cứ ba ngày một lần đến ngày thứ 15. Thể tích chân chuột đo ngay trước khi tiêm thuốc gây viêm được coi là chỉ số đối chứng (ngày 0). Tiến hành đưa chân chuột vào cốc đo thể tích, lượng nước dâng lên sẽ tương ứng với thể tích chân chuột được đánh giá. Số liệu ở các đợt đo sau sẽ được tính so với đối chứng.
Hình 2.2. Hình ảnh đo thể tích chân chuột sử dụng Plethysmometer
b. Đánh giá cảm giác đau do nhiệt
Khi bị kích thích bằng nhiệt vào chân, chuột sẽ co chân lại do đau. Nếu chuột bị đau chân, kích thích bằng nhiệt sẽ tăng cảm giác đau nên chuột sẽ co chân lại sớm hơn. Do đó đánh giá thời gian từ khi kích thích đến khi chuột phản ứng với kích thích nhiệt sẽ cho thấy được mức độ đau của chuột.
Cách xác định:Chuột được cho vào buồng bằng nhựa có đáy bằng kính và được làm quen trong vòng 5 phút. Sau đó nguồn nhiệt sẽ được đặt phía dưới của sàn, ngay dưới hai chân sau. Cường độ của kích thích được tính toán sao cho bình thường chuột sẽ co chân lại trong khoảng 15 đến 20 giây. Thời gian tính từ khi kích thích nhiệt đến
25
khi chuột co chân lại được ghi lại. Thí nghiệm này được đánh giá ở thời điểm trước và sau tiêm thuốc gây viêm, cứ 3 ngày lại ghi lại một lần.
Hình 2.3. Đánh giá cảm giác đau bằng nhiệt (Hot plate)
c. Xác định ngưỡng đau tại cổ chân của chuôt
Khi bị viêm thì ngưỡng đau tại chỗ sẽ giảm đi, vì vậy xác định ngưỡng đau tại chỗ sẽ thấy được mức độ viêm và đau.
Cách xác định: Ngưỡng đau tại chỗ được xác định bằng sử dụng Analgesy- Meter (Ugo Basile). Chuột được giữ thoải mái trên tay, chân sau sẽ được kích thích bằng vật hình nón, đầu tròn (để không gây hại cho động vật), lực kích thích sẽ được tăng dần đến khi chuột cảm thấy đau thì sẽ rút chân ra khỏi vị trí kích thích. Thông số ghi được là lực tác động lên chân chuột khi chuột rút chân khỏi vị trí kích thích. Thông
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});