2.3.2.1. Phương pháp định lượng capsaicin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tham khảo Dược điển Mỹ USP 41, Dược điển châu Âu 8.0 cùng một số tài liệu [32], [21], [52] tiến hành định lượng capsaicin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện:
- Pha động: acetonitril và dung dịch acid phosphoric 1 g/l (40:60, tt/tt)
- Pha tĩnh: cột phenylhexyl (chiều dài 25 cm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm)
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Nhiệt độ: 30oC
- Thể tích tiêm: 20 µl
- Detector huỳnh quang, với bước sóng kích thích và phát xạ lần lượt là 280 và 310 nm.
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn Capsaicin Fluca (61,1% capsaicin), hòa tan bằng methanol. Chuyển dung dịch vào bình định mức 10,0 ml, thêm methanol đến vạch, được dung dịch chuẩn gốc nồng độ capsaicin khoảng 15 mg/ml (S).
Dãy dung dịch chuẩn: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc 50 lần được dung dịch chuẩn 30 µg/ml (S1). Pha loãng dung dịch S1 bằng methanol lần lượt 2, 5, 6, 10 và 20 lần được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 15 (S2), 6 (S3), 5 (S4), 3 (S5) và 1,5 (S6) µg/ml. Pha loãng dung dịch S6 10 lần được dung dịch S7 nồng độ 0,15 µg/ml.
Dung dịch thử: Cắt miếng dán có kích thước 2 x 2 cm. Bóc lớp bảo vệ và ngâm miếng dán với khoảng 7 ml methanol trong 24 giờ rồi siêu âm 15 phút. Dung dịch sau siêu âm đem ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút - trong 10 phút rồi chuyển vào bình định mức 10,0 ml. Thêm methanol tới vạch, lắc đều được dung dịch thử.
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất của miếng dán
Tham khảo tài liệu [3], [51], [52] tiến hành đánh giá khả năng giải phóng dược chất của miếng dán với điều kiện như sau:
- Thiết bị: Thiết bị khuếch tán Franz (thể tích 7 ml, diện tích khuếch tán 1,767 cm2)
- Môi trường: đệm phosphat 7,4 và ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 1:1, tt/tt) - Tốc độ khuấy từ: 600 vòng/phút
19
- Nhiệt độ: 32 ± 0,5oC Cách tiến hành:
Sau khi lấp đầy ngăn nhận bằng môi trường, đặt màng thẩm tích (12 – 14 kDa) phủ kín diện tích khuếch tán bình Franz. Tiến hành cắt miếng dán kích thước 2 x 2 cm, bỏ lớp bảo vệ, đặt lên trên màng thẩm tích, đảm bảo phủ kín diện tích khuếch tán. Tại các thời điểm 2, 4, 6, 8 và 24 giờ, lấy chính xác 0,5 ml môi trường ngăn nhận đem định lượng bằng HPLC, bổ sung bằng đồng lượng môi trường mới.
Lượng capsaicin giải phóng qua màng thẩm tích được xác định theo công thức: Xt = 𝐶𝑐
𝑆𝑐 x 1
𝑆𝑚 x (V1 x Sk + V2 x ∑𝑘𝑡=2𝑆t-1) Trong đó:
- Xt là lượng capsaicin giải phóng qua 1 đơn vị diện tích (μg/cm2)
- Sc, Sk (k là thứ tự các thời điểm lấy mẫu, k = 1, 2, 3, 4, 5) lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử tại các thời điểm 2, 4, 6, 8 và 24 giờ (LU.s)
- Cc là nồng độ dung dịch chuẩn (μg/ml)
- V1 là thể tích môi trường có trong ngăn nhận (ml) - V2 là thể tích môi trường lấy tại các thời điểm t (ml) - Sm là diện tích màng thẩm tích đem thử giải phóng (cm2)
Vẽ đồ thị lượng dược chất giải phóng thẩm tích theo thời gian. Thông lượng khuếch tán J (μg.cm-2.h-1) được xác định bằng cách hồi quy tuyến tính Xt sau khi giải phóng đạt đến cân bằng.
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng thấm dược chất qua da chuột của miếng dán
Chuột nhắt trắng được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 20 ± 3°C và độ ẩm 50 – 60%, với đủ thức ăn và nước uống. 24 giờ trước thí nghiệm, gây tử vong bằng cách làm trật khớp xương sống chuột. Sau đó, loại bỏ lông chuột, lấy phần da lưng và loại bỏ lớp mỡ dưới da. Bảo quản da trong điều kiện 2-8oC. Hoạt hóa lại da bằng nước muối sinh lí ở nhiệt độ 32oC trong 10 phút trước thí nghiệm.
Tiến hành theo điều kiện tương tự đánh giá khả năng giải phóng qua màng thẩm tích. Mẫu ngăn nhận được lấy tại các thời điểm 2, 4, 6, 8 và 24 giờ, định lượng bằng HPLC. Xác định thông lượng J bằng hồi quy tuyến tính lượng capsaicin thấm qua da cho đến khi đạt cân bằng.
20
2.3.2.4. Phương pháp đánh giá tính dính của miếng dán
Mẫu thử được bảo quản trong phòng có nhiệt độ 25 ± 20C từ 30 phút trở lên. Đặt mẫu thử vào vị trí cuối cùng trên đường lăn của bi thép trên dụng cụ đo, mặt dính ngửa lên trên.
Dùng bi thử số 15 (ϕ = 11,1 mm; m = 5,6 g) làm bằng thép không gỉ, thả bi từ trên đỉnh thiết bị, bi lăn xuống tiếp xúc với mẫu thử lăn trên mặt dính đến khi dừng lại.
Độ dính được xác định bằng khoảng cách từ điểm bi tiếp xúc với mặt dính đến điểm bi dừng (điểm dừng của bi). Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 6 lần đo.
Yêu cầu: Giá trị trung bình không được lớn hơn 45 mm.