3.5.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm
a. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm bằng phương pháp đo độ phù bàn chân chuột được thể hiện trong bảng 3.13
Bảng 3.13. Tác dụng chống viêm của miếng dán capsaicin 0,025% được đánh giá bằng thử nghiệm đo độ phù bàn chân chuột (ml)
Ngày
Lô TN Ngày 0 Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12 Ngày 15
Chứng sinh lý 0,94 ± 0,03 1,06 ± 0,10#$ 1,02 ± 0,03#$ 1,04 ± 0,07#$ 1,03 ± 0,06#$ 0,97 ± 0,02#$ Chứng bệnh lý (Viêm) 1,07 ± 0,07 3,03 ± 0,09 3,47 ± 0,26 3,00 ± 0,21 2,42 ± 0,41 2,14 ± 0,33 Viêm + Placebo 1,04 ± 0,05 2,86 ± 0,11 2,98 ± 0,05 2,79 ± 0,04 2,28 ± 0,13 2,05 ± 0,01 Viêm + Wellpatch 1,10 ± 0,12 1,97 ± 0,11*#$ 1,74 ± 0,07*#$ 1,58 ± 0,05*#$ 1,38 ± 0,06*#$ 1,30 ± 0,14*#$ Viêm + Miếng dán capsaicin 1,02 ± 0,06 2,06 ± 0,18*#$ 1,81 ± 0,17*#$ 1,70 ± 0,17*#$ 1,56 ± 0,15*#$ 1,44 ± 0,09*#$
#p < 0,05: so với lô chứng bệnh lý cùng thời điểm; *p < 0,05: so với nhóm sinh lý cùng thời điểm; $p < 0,05: so nhóm placebo cùng thời điểm
43
Nhận xét:
- Tại thời điểm 3 đến 15 ngày sau khi tiêm carrageenan mức độ phù bàn chân chuột ở lô bệnh lý đã tăng đáng kể so với lô chứng sinh lý. Mức độ tăng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
- Tại thời điểm 3 đến 15 ngày mức độ phù bàn chân chuột ở lô điều trị bằng miếng dán capsaicin 0,025% đã giảm đáng kể so với lô chứng sinh lý, đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
- Cả miếng dán capsaicin và Wellpatch đều có tác dụng làm giảm đáng kể mức độ phù bàn chân chuột từ thời điểm ngày thứ 3 đến ngày thứ 15 sau khi tiêm carrageenan, với giá trị p được chỉ ra như trong bảng 3.13. Do đó, có thể kết luận miếng dán capsaicin 0,025% có tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm bởi carrageenan trên chuột cống trắng thực nghiệm được đánh giá bằng thử nghiệm đo độ phù bàn chân chuột.
b. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm qua hình ảnh giải phẫu bệnh bàn chân chuột
Sưng phù là một triệu chứng đặc trưng của viêm. Mức độ sưng phù được đánh giá thông qua hình ảnh giải phẫu về cấu tạo tổ chức và tế bào viêm.
Nhóm chứng sinh lý không điều trị có cấu trúc da hoàn toàn bình thường. Mảnh sinh thiết là da được bao phù bởi biểu mô lát tầng sừng hóa. Bề mặt da bình thường gồm biểu bì, lớp sừng, các nang lông và tuyến bã đi kèm với nang lông (tuyến màu sáng). Chân bì có các nang lông (mũi tên xanh), tuyến bã (mũi tên đỏ). Hoàn toàn không thấy xâm nhiễm viêm.
Hình 3.6. Nhóm chứng âm được tiêm nước muối sinh lý không điều trị
Tình trạng viêm xảy ra rầm rộ ở nhóm bệnh gây viêm không điều trị và nhóm gây viêm điều trị bằng placebo. Hình ảnh giải phẫu cho thấy dưới chân bì có các tổn thương viêm là các ổ apxe nhỏ (mũi tên xanh - hình 3.7), trung tâm có hoại tử và xác
44
bạch cầu. Xâm nhiễm lan tràn các tế bào viêm là bạch cầu N (mũi tên xanh - hình 3.8), đại thực bào và lympho bào, nhiều tế bào khổng lồ dị vật (mũi tên đen - hình 3.7), có nơi bị hoại tử tơ huyết. Các mạch máu xung huyết, xuất huyết mạnh, mô đệm phù nề (mũi tên đỏ). Mô đệm phù thoát ra từ mạch máu chứa rất nhiều bạch cầu đa nhân và tế bào rất bé là một đặc trưng của phản ứng viêm. Tổn thương viêm lan rộng đến lớp mỡ dưới da (mũi tên đen - hình 3.8).
Hình 3.7. Nhóm gây viêm không điều trị
Hình 3.8. Nhóm gây viêm chỉ điều trị bằng tá dược, không chứa cao ớt
Hiệu quả của một thuốc điều trị viêm được đánh giá thông qua số lượng tế bào viêm, mạch máu và mức độ phù của mô đệm. Kết quả cho thấy miếng dán capsaicin 0,025% và chế phẩm trên thị trường Wellpatch đều có tác dụng điều trị viêm. Hình ảnh giải phẫu sau 15 ngày điều trị bằng miếng dán chứa cao mềm định chuẩn ớt cho thấy tác dụng chống viêm tốt hơn Wellpatch do không còn quan sát thấy viêm (hình 3.10). Mảnh sinh thiết da có cấu trúc hoàn toàn bình thường, da được phủ bởi biểu mô lát tầng sừng hóa, chân bì có các nang lông (mũi tên xanh - hình 3.10), tuyến bã (mũi tên đỏ - hình 3.10). Không còn sự xuất hiện của các ổ viêm, bạch cầu, xung huyết và mô đệm không còn phù. Hình ảnh giải phẫu nhóm chứng dương điều trị bằng Wellpatch cho thấy phản ứng viêm đã thuyên giảm đáng kể, mô đệm giảm phù và số lượng tế bào
45
viêm ít đi (mũi tên đỏ - hình 3.9). Còn lại một số tế bào viêm là bạch cầu N (mũi tên xanh - hình 3.9) và mạch máu xung huyết nhẹ.
Hình 3.9. Nhóm gây viêm, điều trị bằng Wellpatch
Hình 3.10. Nhóm gây viêm, điều trị bằng miếng dán capsaicin 0,025%
3.5.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng giảm đau
Kết quả ở bảng 3.14 và bảng 3.15 cho thấy, không có sự khác biệt đáng kể (p > 0,05) về cảm giác đau và ngưỡng đau của chuột tại thời điểm trước khi điều trị (ngày 0) ở tất cả các lô thí nghiệm. Trên cả 2 thử nghiệm nhạy cảm nhiệt và nhạy cảm cơ học, miếng dán capsaicin 0,025% đều có tác dụng giảm đau trên chuột bị viêm gây bởi carrageenan. Đối với thử nghiệm nhạy cảm nhiệt, miếng dán miếng dán capsaicin 0,025% thể hiện tác dụng giảm đau đạt ý nghĩa thống kê bắt đầu từ ngày thứ 9 sau khi tiêm carrageenan (sau 9 ngày điều trị bằng miếng dán). Trong khi đó, trên thử nghiệm nhạy cảm cơ học thể hiện tác dụng giảm đau đáng kể (p < 0,05) bắt đầu từ ngày thứ 9 sau khi tiêm carrageenan (sau 9 ngày điều trị bằng miếng dán).
Như vậy, miếng dán capsaicin 0,025% có tác dụng chống viêm và giảm đau trên mô hình gây viêm bằng carrageenan trên chuột cống trắng.
H.E 20x H.E 40X (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
46
Bảng 3.14. Tác dụng giảm đau của miếng dán capsaicin 0,025% được đo bằng độ nhạy cảm với nhiệt (giây)
Ngày
Lô TN Ngày 0 Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12 Ngày 15
Chứng sinh lý 24,55 ± 4,82 18,79 ± 3,24$ 22,43 ± 3,47 23,54 ± 3,19#$ 27,64 ± 2,32#$ 30,68 ± 1,61#$
Chứng bệnh lý (Viêm) 23,40 ± 6,74 12,41 ± 3,98 14,51 ± 5,92 16,67 ± 2,65 18,77 ± 2,47 21,61 ± 3,37
Viêm + Placebo 27,98 ± 8,62 12,59 ± 1,54 15,82 ± 2,21 17,35 ± 0,28 19,08 ± 0,08 21,01 ± 1,23
Viêm + Wellpatch 23,64 ± 6,15 14,87 ± 2,94 21,77 ± 4,67 26,04 ± 5,03#$ 26,97 ± 3,47#$ 31,77 ± 4,41#$
Viêm + Miếng dán capsaicin 26,29 ± 3,96 14,56 ± 2,70 24,16 ± 6,25 28,36 ± 4,42#$ 30,38 ± 3,22#$ 28,66 ± 2,22#$
#p < 0,05: so với lô chứng bệnh lý cùng thời điểm; *p < 0,05: so với nhóm sinh lý cùng thời điểm; $p < 0,05: so nhóm placebo cùng thời điểm
Bảng 3.15. Tác dụng giảm đau của miếng dán capsaicin 0,025% được đo bằng độ nhạy cảm cơ học (N)
Ngày
Lô TN Ngày 0 Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12 Ngày 15
Chứng sinh lý 6,44 ± 0,70 5,91 ± 0,84#$ 6,82 ± 0,54#$ 7,33 ± 0,07#$ 7,12 ± 0,03#$ 6,96 ± 0,06#$
Chứng bệnh lý (Viêm) 7,32 ± 0,83 3,87 ± 0,25 3,98 ± 0,11 4,08 ± 0,20 4,69 ± 0,38 4,66 ± 0,39
Viêm + Placebo 6,94 ± 0,57 3,79 ± 0,22 4,08 ± 0,13 4,27 ± 0,07 4,50 ± 0,06 4,93 ± 0,15
Viêm + Wellpatch 7,03 ± 0,87 4,20 ± 0,63* 4,68 ± 0,58* 5,45 ± 0,48*#$ 6,10 ± 0,45*#$ 6,49 ± 0,55#$
Viêm + Miếng dán capsaicin 7,11 ± 0,79 4,29 ± 0,75* 4,40 ± 0,44* 5,11 ± 0,39*#$ 6,11 ± 0,52*#$ 6,58 ± 0,42#$
47
3.5.2.3. Bàn luận kết quả tác dụng dược lý của miếng dán tối ưu
Theo nghiên các cứu trước đây, capsaicin trong cao ớt có tác dụng chống viêm và giảm đau liên quan đến cơ chế kích hoạt receptor TRPV-1. Receptor TRPV-1 là một kênh cation không chọn lọc, nằm chủ yếu ở tế bào thụ cảm trên da và có thể bị kích thích bởi nhiệt độ (>43oC) dẫn tới hoạt hóa tạo dòng calci đi vào trong tế bào, giải phóng cạn kiệt các neuropeptid gây viêm như chất P và neurokininA từ đó làm giảm viêm và giảm cảm giác đau [20], [38]. Trong khi đó, ngưỡng đau gây rút chân chuột của nhóm điều trị bằng miếng dán capsaicin có sự tăng lên đáng kể so với nhóm bệnh gây viêm không điều trị và nhóm điều trị bằng miếng dán placebo từ ngày thứ 9 của thử nghiệm. Kết quả giải phẫu bệnh bàn chân chuột cho thấy sau 15 ngày điều trị bằng miếng dán chứa cao mềm định chuẩn ớt không còn xâm nhiễm viêm, không xuất hiện bạch cầu và mô đệm không phù. Tóm lại, ngoài tác dụng chống viêm, miếng dán chứa cao mềm định chuẩn ớt (capsaicin 0,025%) đã giúp giảm đau so với chế phẩm Wellpatch và cho khả năng phục hồi nhanh chóng trong khoảng thời gian tối thiểu 3 ngày sau khi bị gây viêm bởi carrageenan.
48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau khi thực hiện đề tài “Tiếp tục nghiên cứu bào chế miếng dán giảm đau
một lớp chứa capsaicin 0,025%”, đã đạt được một số kết quả như sau:
1. Hoàn thiện công thức bào chế và quy trình sản xuất cho miếng dán tối ưu. 2. Từ kết quả sản xuất thử nghiệm ở quy mô 1000 miếng, đã đề xuất được tiêu chuẩn chất lượng của miếng dán chứa capsaicin 0,025%.
Bảng 4.1. Tiêu chuẩn miếng dán capsaicin 0,025%
STT Chỉ tiêu Dự kiến tiêu chuẩn
1 Tính chất Miếng dán đồng nhất, có màu đỏ cam, có độ bắt dính thích hợp.
2 Định tính Thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử tương ứng với thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 Định lượng Hàm lượng capsaicin, C18H27NO3, từ 90,0% đến 110,0% so với lượng ghi trên nhãn.
4 Đồng đều hàm lượng
Hàm lượng của 10 đơn vị không nằm ngoài giới hạn từ 90% đến 110% so với hàm lượng ghi trên nhãn và không có đơn vị nào có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 75% đến 125% so với hàm lượng trung bình. 5 Tính bám dính Khoảng dừng của bi số 15 ≤ 45 mm
6 Thử kích ứng trên da Không ban đỏ hoặc ban đỏ rất nhẹ (vừa đủ nhìn thấy)
3. Đánh giá được tác dụng dược lý của miếng dán tối ưu chứa cao mềm định chuẩn ớt (0,025%) cho kết quả tương đương với chế phẩm trên thị trường.
Kiến nghị
- Tiếp tục sản xuất thử nghiệm miếng dán ở quy mô pilot để hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng miếng dán.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Bộ môn Bào chế (2021), Bào chế và sinh dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
2. Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học.
3. Đỗ Thị Phương Chi (2019), Nghiên cứu đánh giá khả năng giải phóng và tính chất lưu biến của kem capsaicin, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
4. Nguyễn Ngọc Chiến (2019), Nâng quy mô và thẩm định quy trình sản xuất thuốc thành phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
5. Nguyễn Đức Cường (2019), "Thẩm định phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao để ứng dụng trong đánh giá độ ổn định của capsaicin", Tạp chí Y - Dược học Quân sự, 44, tr. 5-12.
6. Nguyễn Tiến Đạt (2020), Nghiên cứu bào chế miếng dán một lớp chứa capsaicin 0,025%, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Tài liệu Tiếng Anh
7. Barthélémy P, Farah N, et al. (1995), "Transcutol-product profile", pp. 1-10. 8. Chan KL Andrew, Hammond Stephen V, et al. (2003), "Applications of
attenuated total reflection infrared spectroscopic imaging to pharmaceutical formulations", 75(9), pp. 2140-2146.
9. Cho Young Ah, Gwak Hye Sun - Drug development, et al. (2004), "Transdermal delivery of ketorolac tromethamine: effects of vehicles and penetration enhancers", 30(6), pp. 557-564.
10. Chu Tianzhe, Wang Chunyan, et al. (2020), "Chiral 4-O-acylterpineol as transdermal permeation enhancers: insights of the enhancement mechanisms of a transdermal enantioselective delivery system for flurbiprofen", 27(1), pp. 723- 735.
11. Cienfuegos NEC, Santos PL, et al. (2017), "Integrated process for purification of capsaicin using aqueous two-phase systems based on ethanol", 106, pp. 1-10.
12. Cilurzo Francesco, Vistoli Giulio, et al. (2014), "An insight into the skin penetration enhancement mechanism of N-methylpyrrolidone", 11(3), pp. 1014- 1021.
13. Colley CS, Kazarian SG, et al. (2004), "Spectroscopic imaging of arteries and atherosclerotic plaques", 74(4), pp. 328-335.
14. Do TP, Nguyen DC, et al. (2021), "The Design of Experiment Approach, Rheology for Optimization of a Topical Anti-inflammatory and Analgesic Cream".
15. Ewing Andrew (2016), "ATR-FTIR spectroscopic imaging to study drug release and tablet dissolution".
16. Gwak Hye Sun, Kim Seung Ung, et al. (2002), "Effect of vehicles and enhancers on the in vitro permeation of melatonin through hairless mouse skin", 25(3), pp. 392-396.
17. Hanh Bui Duc, Neubert Reinhard HH, et al. (2000), "Investigation of drug release from suspension using FTIR-ATR technique: part I. Determination of effective diffusion coefficient of drugs", 204(1-2), pp. 145-150.
18. Harrison Julian E, Watkinson Adam C, et al. (1996), "The relative effect of Azone® and Transcutol® on permeant diffusivity and solubility in human stratum corneum", 13(4), pp. 542-546.
19. Hassib Sonia T, Hassan Ghaneya S, et al. (2017), "Quantitative analysis of anti- inflammatory drugs using FTIR-ATR spectrometry", 186, pp. 59-65.
20. Hayman Mark, Kam Peter CA %J Current Anaesthesia, et al. (2008), "Capsaicin: a review of its pharmacology and clinical applications", 19(5-6), pp. 338-343.
21. HealthCare Medicines European Directorate for the Quality of (2014), (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
European Pharmacopoeia 8.0, Council of Europe: Strassbourg, pp. 798-809. 22. ISO (2010), Biological evaluation of medical devices -Part 10: Tests for
irritation and skin sensitization, pp. 6-13.
23. Kazarian Sergei G, Chan KL Andrew %J Macromolecules (2003), "“Chemical photography” of drug release", 36(26), pp. 9866-9872.
24. Kong Xiangying, Zhang Yanqiong, et al. (2013), "Anti-angiogenic effect of triptolide in rheumatoid arthritis by targeting angiogenic cascade", 8(10), pp. e77513.
25. Li Chunmei, Liu Chao, et al. (2011), "Correlation between rheological properties, in vitro release, and percutaneous permeation of tetrahydropalmatine", 12(3), pp. 1002-1010.
26. Li Yan, Wang Chunyan, et al. (2019), "Permeation-enhancing effects and mechanisms of O-acylterpineol on isosorbide dinitrate: mechanistic insights based on ATR-FTIR spectroscopy, molecular modeling, and CLSM images", 26(1), pp. 107-119.
27. Mak Vivien HW, Potts Russell O, et al. (1990), "Oleic acid concentration and effect in human stratum corneum: non-invasive determination by attenuated total reflectance infrared spectroscopy in vivo", 12(1), pp. 67-75.
28. Matson David J, Broom Daniel C, et al. (2007), "Inflammation-induced reduction of spontaneous activity by adjuvant: A novel model to study the effect of analgesics in rats", 320(1), pp. 194-201.
29. OECD (2015), "Guideline for testing of chemicals: Acute Dermal Irritation/Corrosion", pp. 1-7.
30. Patel Hetal K, Barot Bhavesh S, et al. (2013), "Topical delivery of clobetasol propionate loaded microemulsion based gel for effective treatment of vitiligo: ex vivo permeation and skin irritation studies", 102, pp. 86-94.
31. Pellett Mark A, Watkinson Adam C, et al. (1997), "Comparison of permeability data from traditional diffusion cells and ATR-FTIR spectroscopy. Part II. Determination of diffusional pathlengths in synthetic membranes and human stratum corneum", 154(2), pp. 217-227.
32. Pharmacopeial Convention United States (2018), United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 41‐NF 36), pp. 672-673.
33. Pradhan Rohan, Abd-Elsayed Alaa (2019), "Capsaicin", Pain, Springer, pp. 339-341.
34. Remane Yvonne, Leopold Claudia S, et al. (2006), "Percutaneous penetration of methyl nicotinate from ointments using the laser Doppler technique: bioequivalence and enhancer effects", 33(6), pp. 719-735.
35. Roy Tanushree, Ghosh Saikat %J Indo. Am. J. Pharm. Res (2013), "Animal models of rheumatoid arthritis: correlation and usefulness with human rheumatoid arthritis", 3, pp. 6131-6142.
36. Snekhalatha U, Anburajan M, et al. (2013), "Evaluation of complete Freund’s adjuvant-induced arthritis in a Wistar rat model", 72(4), pp. 375-382.
37. Yang Degong, Liu Chao, et al. (2020), "A systematic approach to determination of permeation enhancer action efficacy and sites: Molecular mechanism investigated by quantitative structure− activity relationship", 322, pp. 1-12. 38. Abdel-Salam Omar M. E. (2014), Capsaicin as a therapeutic molecule,
Springer, New York.
39. Babbar S., Marier J. F., et al. (2009), "Pharmacokinetic analysis of capsaicin