Tiến hành sắc ký trên dãy dung dịch chuẩn nồng độ từ 0,15 µg/ml đến 30 µg/ml. Ghi lại sắc ký đồ. Khảo sát mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của chất cần phân tích bằng hồi quy bình phương tối thiểu.
Kết quả trên hình 3.1 cho thấy giá trị R2 = 0,9987, thể hiện có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ trong khoảng nồng độ nghiên cứu.
Hình 3.1. Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ capsaicin 3.1.3.Độ lặp lại
Tiến hành sắc ký trên 6 mẫu thử riêng biệt có nồng độ tương tự nhau. Ghi lại sắc ký đồ. Xác định độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích pic chất cần phân tích bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD.
y = 17.968x + 7.7635 R² = 0.9987 0 100 200 300 400 500 600 0 5 10 15 20 25 30 35 D iện tí ch pi c (Lu.s) Nồng độ dung dịch (µg/ml)
28
Bảng 3.1. Độ lặp lại phương pháp phân tích
Lần Thời gian lưu
(phút) Diện tích pic (Lu.s) 1 21,703 56,7 2 21,688 56,6 3 21,673 55,4 4 21,656 56.6 5 21,615 57,4 6 21,700 56,4 Trung bình 21,673 56,52 RSD 0,15% 1,14%
Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic đều nhỏ hơn 2%. Điều đó chứng tỏ phương pháp phân tích có độ lặp lại đạt yêu cầu.
3.2.Đánh giá chế phẩm đối chiếu
Để làm căn cứ tiếp tục hoàn thiện miếng dán, tiến hành đánh giá chất lượng miếng dán đối chiếu Wellpatch thu được kết quả như bảng 3.2.
Bảng 3.2. Chất lượng chế phẩm đối chiếu
Tiêu chí Kết quả
Tính chất Miếng dán đồng nhất, màu trắng, bắt dính tốt.
Định lượng Hàm lượng capsaicin, C18H27NO3, trên một đơn vị diện tích miếng dán là 18,1 ± 0,03 µg/cm2
Giải phóng dược chất
Thông lượng thấm dược chất qua da chuột là 0,322 ± 0,088 µg.cm-2.h-1
Tính dính Công kéo miếng dán khỏi bề mặt chuẩn 12,5 - 16,5 mJ
3.3.Hoàn thiện công thức bào chế miếng dán tối ưu
3.3.1.Ảnh hưởng của chất tăng thấm đến khả năng thấm của dược chất
3.3.1.1. Đánh giá khả năng thấm qua da chuột
Chất tăng thấm có cơ chế chính là làm giảm tính cản trở của lớp sừng trên da. Vì vậy, ảnh hưởng của N-methyl pyrrolidon và Transcutol đến khả năng thấm dược chất qua da sẽ được nghiên cứu kỹ về khả năng thấm dược chất qua da chuột.
29
Hình 3.2. Ảnh hưởng của chất tăng thấm đến khả năng giải phóng dược chất của miếng dán qua da chuột
Kết quả định lượng cho thấy mẫu chứa NMP có lượng capsaicin giải phóng trên một đơn vị diện tích tại từng thời điểm lấy mẫu đều cao hơn nhiều so với mẫu có chứa TCT. Cụ thể, thông lượng thấm qua da mỗi giờ của miếng dán chứa NMP là 0,81 ± 0,08 (µg/cm2.h-1) gấp hơn 3 lần so với thông lượng thấm qua da mỗi giờ của miếng dán chứa TCT là 0,261 (µg/cm2.h-1).
3.3.1.2. Phân tích ảnh hưởng của chất tăng thấm tới cấu trúc da
Từ kết quả đánh giá in vitro bằng thiết bị khuếch tán Franz có thể thấy da là một rào cản đáng kể khi thấm dược chất qua da. Công cụ ATR-FTIR là một công cụ đã được chứng minh rằng có khả năng phát hiện tương tác xảy ra bên trong lớp sừng sẽ được ứng dụng để làm rõ hơn kết quả này.
0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 L ượn g gi ải p hó ng (µ g/ cm 2 )
Thời gian (giờ)
30
Hình 3.3. Phổ ATR-FTIR của da với công thức thiết kế
Nghiên cứu ATR-FTIR của da được sử dụng để cung cấp các dải ở các số sóng khác nhau được cho là do dao động các phân tử lipid và protein trong lớp sừng. Trong nghiên cứu này, phổ của biểu bì da chuột được chọn làm tham chiếu để đánh giá ảnh hưởng có thể có tới cấu trúc lớp sừng bởi sự xâm nhập của các chất tăng thấm. Ảnh hưởng này có thể phát hiện nhờ vào sự dịch chuyển vị trí các đỉnh dao động tới số sóng cao hơn hoặc bằng sự gia tăng chiều rộng đỉnh của chúng. Các số sóng và vị trí đỉnh trong quang phổ da được tham khảo tài liệu [12], trong đó bao gồm các dao động kéo giãn không đối xứng (vasCH2, khoảng 2920 cm-1) và dao động đối xứng (vsCH2, khoảng 2850 cm-1) của lipid lớp sừng, amid I (khoảng 1638 cm-1) và amid II (khoảng 1543 cm-1) của keratin lớp sừng. Tuy nhiên không có sự thay đổi đáng kể nào trong các dao động bên trong và dao động kéo giãn đối xứng (vsCH2) giữa các nhóm khi sử dụng chất tăng thấm khác nhau. Điều này cho thấy không có tương tác xảy ra giữa thành phần chất tăng thấm và thành phần lớp sừng.
3.3.1.3. Ảnh hưởng của chất tăng thấm tới khả năng hydrat hóa trên da
Lớp sừng trên da có khoảng 15 - 20 lớp tế bào chết, là hàng rào ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật và hóa chất, cũng có tác dụng kiểm soát quá trình thoát nước qua da. Khi có sự tiếp xúc với nước, các lớp tế bào sừng hóa này sẽ hút nước và trương nở, qua đó làm giảm khả năng ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật cũng như
31
hóa chất. Đồng thời, khi trương nở như vậy lớp sừng cũng tăng khả năng lưu giữ thuốc tại đây. Như vậy, mức độ hydrat hóa lớp sừng trên da sẽ tỷ lệ thuận với mức độ lưu giữ dược chất trên da. Đối với các chế phẩm bôi ngoài da có tác dụng tại chỗ cần nâng cao mức độ hydrat hóa lớp sừng qua đó tăng mức độ lưu giữ dược chất trên da. Kết quả đánh giá khả năng hydrat hóa trên da chuột được thể hiện qua ảnh chụp bề dày lớp sừng hình PL 3, hình 3.4 và bảng PL 4.
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn bề dày lớp sừng sau 24h bôi chế phẩm (n=6)
Nhận xét:
+ Mẫu da chuột không bôi chế phẩm có độ dày lớp sừng 18,76 ± 2,2 µm nhỏ hơn mẫu da chuột bôi gel thường có lớp sừng dày 24,58 ± 1,04 µm, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
+ Mẫu da chuột bôi gel NMP có độ dày lớp sừng lớn nhất 25,66 ± 2,34 µm, nhưng không có sự khác biệt so với mẫu gel thường (p > 0,05).
+ Mẫu da chuột bôi gel TCT có độ dày lớp sừng là bé nhất 15,15 ± 0,56 µm. Bề dày mẫu da chuột bôi gel TCT nhỏ hơn da chuột không bôi chế phẩm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả này trái với thực tế là khi bôi gel lên da có sự tiếp xúc với nước làm cho lớp sừng hút nước và trương nở.
3.3.1.4. Bàn luận về kết quả đánh giá ảnh hưởng của chất tăng thấm đến khả năng thấm dược chất qua da
NMP có xu hướng làm tăng khả năng thấm dược chất qua da, trong khi TCT thì ngược lại. Trong ngành dược, NMP được sử dụng như một đồng dung môi, tăng độ tan của dược chất trong thuốc tiêm và thuốc uống. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả
0 5 10 15 20 25 30 Độ dày lớp sừ ng (µm ) Công thức (n=6)
32
năng cải thiện tính thấm qua da của NMP đối với các dược chất. Cilurzo và cộng sự đã chỉ ra NMP tăng gấp đôi lượng propanolol thấm qua da người in vitro nhưng không ảnh hưởng đến lượng thấm của hydrocortison [12]. Một số nghiên cứu đã so sánh khả năng tăng thấm của NMP và TCT. Nghiên cứu của Li và cộng sự chỉ ra NMP tăng thấm tetrahydropalmatine đến 2,69 lần, trong khi TCT chỉ tăng 1,68 lần. Lí giải điều này là NMP thay đổi khả năng hòa tan của vùng thân nước trong lớp sừng, giữa đầu phân cực của lớp lipid kép, từ đó dược chất tăng phân bố vào da, và tăng thấm qua da, còn TCT chỉ là hợp chất hút ẩm, hấp thụ nước vào trong da, tối đa hoạt độ động học của dược chất, để thay đổi tính thấm của chúng [25]. Wen và cộng sự cũng cho thấy NMP tăng thấm daphnetin tốt hơn TCT ở nồng độ 5% [53].
Sử dụng phổ ATR-FTIR các tác giả nhận thấy cả NMP và TCT đều không làm thay đổi và xáo trộn cấu trúc của lớp sừng trên da. Có thể giả định khả năng tăng thấm tốt hơn của NMP là do sự việc tạo thành liên kết hydro và tương tác π-π của NMP với hệ vòng thơm của capsaicin dẫn đến việc tăng thấm capsaicin qua da theo cơ chế đồng vận chuyển tạo thành một ổ chứa dược chất tại lớp sừng. Nghiên cứu của Cilurzo và cộng sự bằng phân tích phổ ATR-FTIR cho thấy không có tương tác nào xảy ra làm thay đổi cấu trúc lớp sừng khi thêm NMP. Kết hợp với mô phỏng động lực học phân tử, tác giả chứng minh được việc tạo thành liên kết hydro và tương tác π-π của NMP và hệ vòng thơm của propanolol, tạo thành tiểu phân, từ đó tăng thấm qua cơ chế đồng vận chuyển [12]. TCT là một chất hòa có khả năng hòa tan mạnh được sử dụng trong một số dạng bào chế và được coi là một chất tăng thấm không độc tính, không làm thay đổi cấu trúc da, có khả năng tan tốt trong nhiều dung môi phân cực và không phân cực [7]. Các công bố trước đây sử dụng kỹ thuật DSC và FTIR để nghiên cứu Transcutol đã cho thấy TCT không thể phá vỡ cấu trúc lipid biểu bì hoặc tính toàn vẹn cấu trúc của da [9], [16], [18], [34]. Trong một nghiên cứu so sánh tác dụng của nhiều chất tăng thấm bao gồm acid béo, Gwak kết luận rằng TCT chỉ đơn thuần làm giảm sự phân chia của hoạt chất bằng cách tăng khả năng hòa tan của nó trong da, sau đó dẫn đến cải thiện phân vùng thuốc trong da [16]. Cơ chế tăng thấm chính của Transcutol được cho là do tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân phối và khuếch tán thuốc vào da. Một nghiên của Harrison về khả năng tăng thấm qua da của Transcutol khi sử dụng ATR-FTIR và phép đo thông lượng tế bào khuếch tán kiểu Franz cho thấy TCT trong nước đã làm tăng mức độ thấm của 4-cyanophenol qua da người lên khoảng hai lần so
33
với mẫu da đối chứng bão hòa trong nước [18]. Từ kết quả quang phổ ATR-FTIR, các tác giả đã khẳng định rằng Transcutol dường như không tác dụng vào cấu trúc lớp sừng, mà tăng thấm của da bằng cách tăng khả năng hòa tan của hoạt chất trong lớp sừng.
Không có sự khác biệt rõ ràng của gel có chứa NMP và gel thường đến khả năng hydrat hóa trên da chuột. Mẫu gel chứa chất tăng thấm TCT lại cho bề dày nhỏ nhất, điều này có thể lí giải do bản chất TCT là một chất tương tác mạnh với nước, hút nước mạnh từ da ra bề mặt làm giảm sự hydrat hóa. Từ đó, ta có thể kết luận rằng đánh giá hydrat hóa trên da phụ thuộc vào bản chất của gel và không phải là phương pháp hữu hiệu trong việc đánh giá sự khác biệt về khả năng tăng cường thẩm thấu của các chất tăng thấm khác nhau.
3.3.2.Công thức tối ưu tại phòng thí nghiệm
Như vậy sau giai đoạn thiết kế và tối ưu, các thành phần chính trong miếng dán tối ưu gồm:
Bảng 3.3. Thành phần và hàm lượng miếng dán (140 cm2)
STT Thành phần Khối lượng (gam)
1 Cao ớt (chứa 1,5% capsaicin) 0,1459
2 N-methyl pyrrolidon 0,4375
3 Viscomate NP-700 0,525
4 Glycerin 3,5
5 Nhôm hydroxid dạng gel khô 0,0175
6 Acid tartaric 0,0105
7 Nước RO Vừa đủ 8,75
3.3.3.Quy trình tối ưu tại phòng thí nghiệm
- Bột Viscomate NP-700 và nhôm hydroxyd dạng gel khô được trộn đều và phân tán vào glycerin bằng máy khuấy từ, với tốc độ 200 vòng/phút, đến khi đồng nhất.
- Hòa tan acid tartaric vào nước, rồi phối hợp dung dịch này vào hỗn dịch glycerin, tiếp tục khuấy trộn bằng khuấy từ, Viscomate gặp nước trương nở tạo gel.
34
- Hòa tan cao ớt vào dung dịch NMP rồi phối hợp vào khối gel cho đến khi đồng nhất.
- Cán mỏng khối gel lên lớp bảo vệ bằng dụng cụ cán phim cầm tay ở độ dày 500 µm, cán tiếp lớp đế lên trên và để ổn định trong 48 giờ.
3.4.Bước đầu sản xuất thử nghiệm quy mô 1000 miếng/mẻ
Do điều kiện về thời gian và trang thiết bị nên trong phạm vi nghiên cứu này chỉ tiến hành sản xuất thử nghiệm miếng dán capsaicin 0,025% ở quy mô 1000 miếng. Tham khảo tài liệu [1]
3.4.1.Mô tả quy trình bào chế miếng dán giảm đau một lớp chứa capsaicin
3.4.1.1. Công thức
Bảng 3.4. Công thức cho một mẻ 1000 miếng dán
Tên nguyên liệu Công thức 1
miếng dán Công thức 1000 miếng dán Chức năng Tiêu chuẩn Cao mềm định chuẩn ớt
(chứa 1,5% capsaicin) 0,1459 g 0,1459 kg Hoạt chất EP 8.0
N-methyl pyrrolidon 0,4375 g 0,4375 kg Tá dược TCCS
Viscomate NP-700 0,525 g 0,525 kg Tá dược TCCS
Glycerin 3,5 g 3,5 kg Tá dược TCCS
Nhôm hydroxyd dạng
gel khô 17,5 mg 17,5 g Tá dược TCCS
Acid tartaric 10,5 mg 10,5 g Tá dược TCCS
Nước RO 4,12 g 4,12 kg Tá dược DĐVN V Tổng khối lượng cốt 8,75 g 8,75 kg Vải 140 cm2 14 m2 Lớp bảo vệ TCCS Màng phim 140 cm2 14 m2 Lớp bảo vệ TCCS
3.4.1.2. Mô tả giai đoạn bào chế (i). Pha chế
- Cho glycerin vào nồi máy trộn keo, phân tán bột viscomate và nhôm hydroxyd dạng gel khô vào glycerin bằng máy trộn hành tinh với tốc độ 200 vòng/phút, đến khi
35
đồng nhất, thời gian trộn 20 phút.
- Hòa tan acid tartaric vào nước trong bình inox, rồi phối hợp dung dịch acid vào hỗn dịch glycerin. Tiến hành khuấy trong máy trộn chân không ZKJ-50, trong khoảng thời gian 20 phút để tạo khối hydrogel.
- Phân tán cao mềm định chuẩn ớt vào NMP rồi phối hợp dược chất vào khối gel, trộn trong máy trộn chân không ZKJ-50 cho đến khi đồng nhất. Thời gian 30 phút.
(ii). Tráng keo, tạo miếng dán
- Thiết bị: Máy tráng keo nước. + Kích thước miếng dán 14 x 10 cm. + Tốc độ máy: 40 – 50 nhịp/phút.
- Kiểm soát trong quá trình tráng keo và cắt miếng: Miếng dán hình chữ nhật, chứa lớp hydrogel màu cam trên nền vải bảo vệ và phủ màng phim trong suốt. Không có lỗ thủng, không có bọt khí, không có tinh thể dược chất kết tinh trong lớp keo. Vải và màng phim không bị nhàu nát.
- Sau khi cắt miếng, bán thành phẩm được để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sau đó được lấy mẫu để kiểm tra bán thành phẩm.
- Kiểm nghiệm bán thành phẩm miếng dán: Cảm quan, định lượng, độ đồng đều khối lượng, kiểm tra độ dính của miếng dán.
- Miếng dán đạt tiêu chuẩn được chuyển qua đóng túi nhôm (đóng gói cấp 1).
(iii). Đóng gói: Đóng túi nhôm
+ Cảm quan: Túi sạch, nguyên vẹn, không có vết bẩn dính lên phần miệng túi, không móp méo. Số lô, hạn sử dụng được in đầy đủ và đúng với hồ sơ lô.
+ Số lượng: 2 miếng/túi.
36
3.4.1.3. Sơ đồ quy trình bào chế
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình sản xuất miếng dán capsaicin 0,025%
3.4.2.Bước đầu thẩm định quy trình sản xuất miếng dán chứa cao mềm định chuẩn
ớt có hàm lượng capsaicin 0,025%
3.4.2.1. Các thông số trọng yếu và đánh giá nguy cơ trong quá trình bào chế miếng dán
Xem xét từng giai đoạn của quy trình bào chế để đánh giá các yếu tố nguy cơ ảnh hưởng và có thể làm cho quy trình bào chế không ổn định. Từ đó đề xuất biện pháp xử lý để hạn chế các nguy cơ này.
37
Bảng 3.5. Đánh giá nguy cơ ảnh hưởng đến độ ổn định của quy trình bào chế
Các giai đoạn Nguy cơ dự kiến Tần suất Ảnh hưởng Khả năng phát hiện Chỉ tiêu
kiểm soát Biện pháp xử lý
Tạo hỗn dịch dính Độ bắt dính không đều Thấp Trung bình Trung