Tham khảo tài liệu [22], [29] kết hợp với sự phù hợp phòng thí nghiệm, quá trình đánh giá khả năng gây kích ứng của miếng dán CAP trên da thỏ thực hiện như sau:
22
Sử dụng thỏ trắng trưởng thành, đực hoặc cái (không sử dụng thỏ có thai hoặc đang cho con bú), khoẻ mạnh, cân nặng không dưới 2 kg. Thỏ được nhốt riêng từng con, nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thử.
Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhiệt độ phòng 25 ± 30C, độ ẩm tương đối 30-70%, ánh sáng đảm bảo 12 giờ tối, 12 giờ sáng hàng ngày.
- Chuẩn bị mẫu
Mẫu thử là các miếng dán giảm đau đạt tiêu chuẩn đã xây dựng. Mẫu chứng là miếng dán placebo không chứa cao ớt.
- Tiến hành
Trước ngày thí nghiệm, làm sạch lông thỏ ở vùng lưng đều về hai bên cột sống một khoảng đủ rộng để đặt các mẫu thử và đối chứng (10 x 15 cm). Chỉ những thỏ có da khoẻ mạnh, đồng đều và lành lặn mới được dùng vào thí nghiệm.
Mỗi mẫu được thử trên 06 thỏ.
Sơ đồ đặt mẫu thử có thể bố trí như trong hình PL 2. - Quan sát và ghi điểm
Quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da dán mẫu thử, mẫu chứng với da không dán ở các thời điểm 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ. Có thể kéo dài hơn thời gian quan sát khi có tổn thương sâu để có thể đánh giá đầy đủ hơn về khả năng hồi phục hoặc không hồi phục của vết thương nhưng không nên quá 14 ngày.
- Đánh giá kết quả
Trên mỗi thỏ, điểm phản ứng được tính bằng tổng số điểm ở hai mức độ ban đỏ và phù nề chia cho số lần quan sát. Điểm kích ứng của mẫu thử được lấy trung bình điểm phản ứng của các thỏ đã thử.
Đối chiếu điểm kích ứng với các mức độ qui định trên bảng PL 1 để xác định khả năng gây kích ứng trên da thỏ của mẫu thử.
Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo qui định ở bảng PL 2.
23
2.3.6.Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau trên mô hình in vitro
và trên động vật thí nghiệm
2.3.6.1. Thiết kế nghiên cứu a. Đối tượng nghiên cứu
Chuột cống trắng trưởng thành (150 – 180 g) do Trung tâm Động vật thí nghiệm, Học viện Quân y, được cho ăn uống và nuôi ở nhiệt độ 25 ± 1oC, nhịp ngày đêm là 12h/12h. Chuột được nuôi trong thời gian bảy ngày để thích nghi trước khi tiến hành bất kỳ thao tác thí nghiệm nào.
b. Phương pháp gây viêm và sử dụng miếng dán điều trị
Chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm:
- Nhóm 1(chứng sinh lý): tiêm dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%, không điều trị.
- Nhóm 2 (chứng bệnh lý): gây viêm, không điều trị.
- Nhóm 3 (chứng dương): gây viêm, điều trị bằng miếng dán Wellpatch, 2 lần/ngày, trước khi gây viêm 2 ngày và trong suốt quá trình thí nghiệm.
- Nhóm 4 (placebo): gây viêm, điều trị bằng miếng dán chỉ chứa tá dược, không chứa cao mềm định chuẩn ớt, được dán 2 lần/ngày, trước khi gây viêm 2 ngày và trong suốt quá trình thí nghiệm.
- Nhóm 5(nhóm điều trị): gây viêm, điều trị bằng miếng dán capsaicin 0,025%, được dán 2 lần/ngày, trước khi gây viêm 2 ngày và trong suốt quá trình thí nghiệm.
Chuột được tiêm 0,1 ml carrageenan 1% trong nước muối sinh lý vào bàn chân sau bên phải để gây viêm [35]. Miếng dán kích thước 1 x 1 cm được sử dụng dán lên gan bàn chân chuột. Trong khi đó, các động vật nhóm 1 chỉ được dùng nước muối sinh lý thông thường và được coi là đối chứng bình thường.
Hình 2.1. Hình ảnh chân (P) chuột sưng viêm sau tiêm dung dịch carrageenan 1% 3 ngày
24
2.3.6.2. Phương pháp đánh giá mức độ viêm và đau
Tham khảo tài liệu [14], [28] tiến hành đánh giá mức độ viêm và đau.
a. Đánh giá mức thay đổi thể tích chân chuột
Chuột khi bị viêm chân sẽ sưng to lên (thể tích chân tăng lên), mức độ sưng tương ứng với mức độ viêm. Do đó đánh giá thể tích chân chuột sẽ giúp ta xác định được mức độ viêm.
Cách xác định: Thể tích chân sau của chuột ở hai bên (cùng bên và đối bên gây viêm) được đo bằng phương pháp đo sự thay đổi thể tích nước sử dụng Plethysmometer (Ugo Basile), cứ ba ngày một lần đến ngày thứ 15. Thể tích chân chuột đo ngay trước khi tiêm thuốc gây viêm được coi là chỉ số đối chứng (ngày 0). Tiến hành đưa chân chuột vào cốc đo thể tích, lượng nước dâng lên sẽ tương ứng với thể tích chân chuột được đánh giá. Số liệu ở các đợt đo sau sẽ được tính so với đối chứng.
Hình 2.2. Hình ảnh đo thể tích chân chuột sử dụng Plethysmometer
b. Đánh giá cảm giác đau do nhiệt
Khi bị kích thích bằng nhiệt vào chân, chuột sẽ co chân lại do đau. Nếu chuột bị đau chân, kích thích bằng nhiệt sẽ tăng cảm giác đau nên chuột sẽ co chân lại sớm hơn. Do đó đánh giá thời gian từ khi kích thích đến khi chuột phản ứng với kích thích nhiệt sẽ cho thấy được mức độ đau của chuột.
Cách xác định:Chuột được cho vào buồng bằng nhựa có đáy bằng kính và được làm quen trong vòng 5 phút. Sau đó nguồn nhiệt sẽ được đặt phía dưới của sàn, ngay dưới hai chân sau. Cường độ của kích thích được tính toán sao cho bình thường chuột sẽ co chân lại trong khoảng 15 đến 20 giây. Thời gian tính từ khi kích thích nhiệt đến
25
khi chuột co chân lại được ghi lại. Thí nghiệm này được đánh giá ở thời điểm trước và sau tiêm thuốc gây viêm, cứ 3 ngày lại ghi lại một lần.
Hình 2.3. Đánh giá cảm giác đau bằng nhiệt (Hot plate)
c. Xác định ngưỡng đau tại cổ chân của chuôt
Khi bị viêm thì ngưỡng đau tại chỗ sẽ giảm đi, vì vậy xác định ngưỡng đau tại chỗ sẽ thấy được mức độ viêm và đau.
Cách xác định: Ngưỡng đau tại chỗ được xác định bằng sử dụng Analgesy- Meter (Ugo Basile). Chuột được giữ thoải mái trên tay, chân sau sẽ được kích thích bằng vật hình nón, đầu tròn (để không gây hại cho động vật), lực kích thích sẽ được tăng dần đến khi chuột cảm thấy đau thì sẽ rút chân ra khỏi vị trí kích thích. Thông số ghi được là lực tác động lên chân chuột khi chuột rút chân khỏi vị trí kích thích. Thông số này được đo từ ngay trước khi tiêm thuốc gây viêm và cứ sau 3 ngày một lần trong suốt quá trình điều trị.
26
d. Đánh giá mức độ viêm bằng giải phẫu bệnh bàn chân chuôt
Tham khảo tài liệu [24], [36] rồi tiến hành đánh giá mức độ viêm bằng giải phẫu bệnh bàn chân chuôt như sau:
Sau khi gây viêm và điều trị ở các thời điểm, sau 15 ngày chuột ở các nhóm được giết và lấy tổ chức bàn chân chuột để đánh giá hình ảnh giải phẫu về cấu trúc tổ chức, tế bào viêm tại Khoa Giải phẫu bệnh – pháp y, Bệnh viện Quân y 103.
2.3.7.Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phép phân tích phương sai và phép kiểm test T-Student sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2019 và IBM SPSS Statistics 20.
27
CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.Thẩm định phương pháp định lượng capsaicin bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao
3.1.1.Độ đặc hiệu
Tiến hành sắc ký trên các mẫu thử, mẫu trắng và mẫu chuẩn theo phương pháp phân tích. Ghi lại sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu của chất cần phân tích trong các mẫu.
Kết quả trên hình PL 1 cho thấy thời gian lưu của pic capsaicin trên sắc ký đồ mẫu thử là 21,7 phút, tương tự trên sắc ký đồ mẫu chuẩn. Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic nào ở thời gian lưu trên. Như vậy, tá dược và dung môi không ảnh hưởng đến kết quả định tính và định lượng capsaicin.
3.1.2.Khoảng tuyến tính
Tiến hành sắc ký trên dãy dung dịch chuẩn nồng độ từ 0,15 µg/ml đến 30
µg/ml. Ghi lại sắc ký đồ. Khảo sát mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của
chất cần phân tích bằng hồi quy bình phương tối thiểu.
Kết quả trên hình 3.1 cho thấy giá trị R2 = 0,9987, thể hiện có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ trong khoảng nồng độ nghiên cứu.
Hình 3.1. Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ capsaicin 3.1.3.Độ lặp lại
Tiến hành sắc ký trên 6 mẫu thử riêng biệt có nồng độ tương tự nhau. Ghi lại sắc ký đồ. Xác định độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích pic chất cần phân tích bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD.
y = 17.968x + 7.7635 R² = 0.9987 0 100 200 300 400 500 600 0 5 10 15 20 25 30 35 D iện tí ch pi c (Lu.s) Nồng độ dung dịch (µg/ml)
28
Bảng 3.1. Độ lặp lại phương pháp phân tích
Lần Thời gian lưu
(phút) Diện tích pic (Lu.s) 1 21,703 56,7 2 21,688 56,6 3 21,673 55,4 4 21,656 56.6 5 21,615 57,4 6 21,700 56,4 Trung bình 21,673 56,52 RSD 0,15% 1,14%
Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic đều nhỏ hơn 2%. Điều đó chứng tỏ phương pháp phân tích có độ lặp lại đạt yêu cầu.
3.2.Đánh giá chế phẩm đối chiếu
Để làm căn cứ tiếp tục hoàn thiện miếng dán, tiến hành đánh giá chất lượng miếng dán đối chiếu Wellpatch thu được kết quả như bảng 3.2.
Bảng 3.2. Chất lượng chế phẩm đối chiếu
Tiêu chí Kết quả
Tính chất Miếng dán đồng nhất, màu trắng, bắt dính tốt.
Định lượng Hàm lượng capsaicin, C18H27NO3, trên một đơn vị diện tích miếng dán là 18,1 ± 0,03 µg/cm2
Giải phóng dược chất
Thông lượng thấm dược chất qua da chuột là 0,322 ± 0,088 µg.cm-2.h-1
Tính dính Công kéo miếng dán khỏi bề mặt chuẩn 12,5 - 16,5 mJ
3.3.Hoàn thiện công thức bào chế miếng dán tối ưu
3.3.1.Ảnh hưởng của chất tăng thấm đến khả năng thấm của dược chất
3.3.1.1. Đánh giá khả năng thấm qua da chuột
Chất tăng thấm có cơ chế chính là làm giảm tính cản trở của lớp sừng trên da. Vì vậy, ảnh hưởng của N-methyl pyrrolidon và Transcutol đến khả năng thấm dược chất qua da sẽ được nghiên cứu kỹ về khả năng thấm dược chất qua da chuột.
29
Hình 3.2. Ảnh hưởng của chất tăng thấm đến khả năng giải phóng dược chất của miếng dán qua da chuột
Kết quả định lượng cho thấy mẫu chứa NMP có lượng capsaicin giải phóng trên một đơn vị diện tích tại từng thời điểm lấy mẫu đều cao hơn nhiều so với mẫu có chứa TCT. Cụ thể, thông lượng thấm qua da mỗi giờ của miếng dán chứa NMP là 0,81 ± 0,08 (µg/cm2.h-1) gấp hơn 3 lần so với thông lượng thấm qua da mỗi giờ của miếng dán chứa TCT là 0,261 (µg/cm2.h-1).
3.3.1.2. Phân tích ảnh hưởng của chất tăng thấm tới cấu trúc da
Từ kết quả đánh giá in vitro bằng thiết bị khuếch tán Franz có thể thấy da là một rào cản đáng kể khi thấm dược chất qua da. Công cụ ATR-FTIR là một công cụ đã được chứng minh rằng có khả năng phát hiện tương tác xảy ra bên trong lớp sừng sẽ được ứng dụng để làm rõ hơn kết quả này.
0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
L
ượn
g
gi
ải
p
hó
ng
(µ
g/
cm
2)
Thời gian (giờ)
30
Hình 3.3. Phổ ATR-FTIR của da với công thức thiết kế
Nghiên cứu ATR-FTIR của da được sử dụng để cung cấp các dải ở các số sóng khác nhau được cho là do dao động các phân tử lipid và protein trong lớp sừng. Trong nghiên cứu này, phổ của biểu bì da chuột được chọn làm tham chiếu để đánh giá ảnh hưởng có thể có tới cấu trúc lớp sừng bởi sự xâm nhập của các chất tăng thấm. Ảnh hưởng này có thể phát hiện nhờ vào sự dịch chuyển vị trí các đỉnh dao động tới số sóng cao hơn hoặc bằng sự gia tăng chiều rộng đỉnh của chúng. Các số sóng và vị trí đỉnh trong quang phổ da được tham khảo tài liệu [12], trong đó bao gồm các dao động kéo giãn không đối xứng (vasCH2, khoảng 2920 cm-1) và dao động đối xứng (vsCH2, khoảng 2850 cm-1) của lipid lớp sừng, amid I (khoảng 1638 cm-1) và amid II (khoảng 1543 cm-1) của keratin lớp sừng. Tuy nhiên không có sự thay đổi đáng kể nào trong các dao động bên trong và dao động kéo giãn đối xứng (vsCH2) giữa các nhóm khi sử dụng chất tăng thấm khác nhau. Điều này cho thấy không có tương tác xảy ra giữa thành phần chất tăng thấm và thành phần lớp sừng.
3.3.1.3. Ảnh hưởng của chất tăng thấm tới khả năng hydrat hóa trên da
Lớp sừng trên da có khoảng 15 - 20 lớp tế bào chết, là hàng rào ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật và hóa chất, cũng có tác dụng kiểm soát quá trình thoát nước qua da. Khi có sự tiếp xúc với nước, các lớp tế bào sừng hóa này sẽ hút nước và trương nở, qua đó làm giảm khả năng ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật cũng như
31
hóa chất. Đồng thời, khi trương nở như vậy lớp sừng cũng tăng khả năng lưu giữ thuốc tại đây. Như vậy, mức độ hydrat hóa lớp sừng trên da sẽ tỷ lệ thuận với mức độ lưu giữ dược chất trên da. Đối với các chế phẩm bôi ngoài da có tác dụng tại chỗ cần nâng cao mức độ hydrat hóa lớp sừng qua đó tăng mức độ lưu giữ dược chất trên da. Kết quả đánh giá khả năng hydrat hóa trên da chuột được thể hiện qua ảnh chụp bề dày lớp sừng hình PL 3, hình 3.4 và bảng PL 4.
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn bề dày lớp sừng sau 24h bôi chế phẩm (n=6)
Nhận xét:
+ Mẫu da chuột không bôi chế phẩm có độ dày lớp sừng 18,76 ± 2,2 µm nhỏ hơn mẫu da chuột bôi gel thường có lớp sừng dày 24,58 ± 1,04 µm, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).
+ Mẫu da chuột bôi gel NMP có độ dày lớp sừng lớn nhất 25,66 ± 2,34 µm, nhưng không có sự khác biệt so với mẫu gel thường (p > 0,05).
+ Mẫu da chuột bôi gel TCT có độ dày lớp sừng là bé nhất 15,15 ± 0,56 µm. Bề dày mẫu da chuột bôi gel TCT nhỏ hơn da chuột không bôi chế phẩm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả này trái với thực tế là khi bôi gel lên da có sự tiếp xúc với nước làm cho lớp sừng hút nước và trương nở.
3.3.1.4. Bàn luận về kết quả đánh giá ảnh hưởng của chất tăng thấm đến khả năng thấm dược chất qua da
NMP có xu hướng làm tăng khả năng thấm dược chất qua da, trong khi TCT thì ngược lại. Trong ngành dược, NMP được sử dụng như một đồng dung môi, tăng độ tan của dược chất trong thuốc tiêm và thuốc uống. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả
0 5 10 15 20 25 30 Độ dày lớp sừ ng (µm ) Công thức (n=6)
32
năng cải thiện tính thấm qua da của NMP đối với các dược chất. Cilurzo và cộng sự đã chỉ ra NMP tăng gấp đôi lượng propanolol thấm qua da người in vitro nhưng không ảnh hưởng đến lượng thấm của hydrocortison [12]. Một số nghiên cứu đã so sánh khả năng tăng thấm của NMP và TCT. Nghiên cứu của Li và cộng sự chỉ ra NMP tăng thấm tetrahydropalmatine đến 2,69 lần, trong khi TCT chỉ tăng 1,68 lần. Lí giải điều này là NMP thay đổi khả năng hòa tan của vùng thân nước trong lớp sừng, giữa đầu phân cực của lớp lipid kép, từ đó dược chất tăng phân bố vào da, và tăng thấm qua da, còn TCT chỉ là hợp chất hút ẩm, hấp thụ nước vào trong da, tối đa hoạt độ động học
