3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.3. Phương pháp thử các ựặc tắnh sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập ựược
phân lập ựược
3.5.3.1. Thử phản ứng Oxydase
Tiến hành trên giấy ựược thấm 1% dung dịch Tetrametyl Ờ p Ờ Phenylenediamine hydrochloridẹ Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên trên mặt giấy ựã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tắm ựen sau 30 giây là phản ứng dương tắnh. Nếu không thấy xuất hiện màu tắm ựen hoặc không ựổi màu là phản ứng âm tắnh.
3.5.3.2. Thử phản ứng Catalase
Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch ựặt lên một ựiểm trên phiến kắnh sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên trên, trộn ựều, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tắnh.
Thử phản ứng Urease
Cấy giống vi khuẩn cần thử vào ống môi trường ure và bồi dưỡng trong tủ ấm 370C, sau 4 Ờ 24 giờ thì ựọc kết quả.
Nếu dung dịch có màu hồng thì phản ứng dương tắnh. Dung dịch không chuyển màu thì phản ứng âm tắnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30 Ria cấy
Tủ ấm 370C/ 24 giờ/ 5% CO2
Hình 3.1. Sơ ựồ phân lập vi khuẩn
Dịch ngoáy mũi hoặc mẫu phổi
Nuôi cấy trên các môi trường thắch hợp
(Nước thịt, thạch máu, thạch TSA, thạch MacConkey, thạch Chocolate, thạch BHI)
Phân lập, thuần khiết từng loại khuẩn lạc
Nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn
Cấy chuyển vào các môi trường chọn lọc
Giám ựịnh vi khuẩn qua các ựặc tắnh sinh hóa và lên men ựường
Thử ựộc lực Thử kháng sinh ựồ
định type
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
3.5.3.3. Thử phản ứng Indol
Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường nước thịt hoặc nước pepton và ựể tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Nhỏ 0,5 ml dung dịch KovacỖs vào, phản ứng dương tắnh khi quan sát thấy một vòng ựỏ trên mặt môi trường.
+ Với vi khuẩn Actinobacillus và Haemophilus cần nuôi cấy trên môi trường TSB có bổ sung 1% fresh yeast extract và 5% huyết thanh ngựa thay cho nước thịt hoặc nước pepton và nuôi cấy ở ựiều kiện 370C với 5% CO2 trong 24 giờ.
3.5.3.4. Các phản ứng lên men ựường:
Dùng môi trường pepton cho thêm 1% chỉ thị màu xanh bromthymol lắc ựều, phân phối vào các ống nghiệm ở ựáy ựã có sẵn 1 ống ựuy Ờ ham, hấp ướt 1200C trong 30 phút. Sau ựó cho ựường ựã pha, hấp ướt 1100C trong 20 Ờ 30 phút. Cấy giống vi khuẩn cần chẩn ựoán vào những ống môi trường pepton có ựường trên rồi ựể trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Phản ứng dương tắnh nếu môi trường chuyển sang màu vàng và nếu có sinh hơi thì mực nước trong ống ựuy Ờ ham bị tụt xuống. Phản ứng âm tắnh, môi trường vẫn là màu xanh lơ.
3.5.3.5. Phương pháp xác ựịnh nhu cầu yếu tố V (Killian, 1976)
Phương pháp này ựể thử nhu cầu yếu tố V của H. parasuis: Dùng que cấy chọn khuẩn lạc nghi H. parasuis ria thành nhiều ựường gấp khúc nối tiếp nhau trên ựĩa thạch máụ Dùng một que cấy khác cấy một ựường vi khuẩn Stạ aureus cắt ngang những ựường trên. Sau khi nuôi cấy 24 Ờ 36 giờ ở 370C vi khuẩn H. parasuis sẽ phát triển thành những khuẩn lạc nhỏ như ựầu ựinh ghim, tròn, trong và mọc xung quanh ựường cấy Stạ aureus.
3.5.3.6. Phương pháp thử phản ứng CAMP
Cấy một ựường cấy thẳng chủng vi khuẩn Stạ aureus (chủng gây dung huyết anpha và beta) lên ựĩa thạch TSA (ựã bổ sung 1 Ờ 3% NAD và 5% huyết thanh ngựa) với 10% máụ Sau ựó cấy các chủng vi khuẩn cần kiểm tra là Ạ pleuropneumoniae vuông góc và cách ựường cấy Stạ aureus 2 Ờ 3mm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 Bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Phản ứng CAMP dương tắnh khi xuất hiện vùng dung huyết hoàn toàn hình mũi tên nơi tiếp giáp giữa ựường cấy Ạ pleuropneumoniae nghi với vùng dung huyết beta của Stạ aureus.
Các phản ứng sinh hoá ựược thử bằng hệ thống API 20 Strep.