Từ kết quả nghiên cứu trước [7], tác giả đã lựa chọn hệ dung môi ethylacetat: methanol (10:1) làm hệ dung môi chạy cột để tinh chế kháng sinh. Tuy nhiên, khi khảo sát lại chúng tôi thấy khả năng tách của hệ này trên SKLM chưa tốt, do đó chúng tôi tiến hành khảo sát để tìm ra hệ dung môi chạy cột tốt hơn cho quá trình tinh chế tiếp theo.
Đầu tiên, khảo sát một số hệ dung môi bằng cách thay đổi tỷ lệ ethylacetat. Các hệ dung môi được khảo sát bao gồm ethylacetat: methanol với các tỷ lệ là 20:1; 25:1; 30:1; 35:1. Kết quả SKLM cho thấy hệ dung môi
36
ethylacetat: methanol với tỷ lệ 20:1 cho khả năng tách các kháng sinh trên bản mỏng tốt nhất, vết sắc ký tròn, gọn nhất so với các hệ dung môi khác.
Đưa hệ dung môi ethylacetat: methanol (20:1) lên cột Silicagel để tách hỗn hợp kháng sinh P1, thu 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 3ml, tiến hành SKLM từng phân đoạn thu được kết quả như sau:
Bảng 3.10: Kết quả SKLM các phân đoạn
Phân đoạn Số vết Rf vết 1 Rf vết 2
1 1 0,76 -
2-16 2 0,75 0,68
17-30 1 - 0,68
Từ bảng 3.10 cho thấy khi sử dụng hệ ethylacetat: methanol (20:1), các vết sắc ký tách tốt trên bản mỏng nhưng trên cột các kháng sinh tách vẫn chưa tốt. Do đó cần cải tiến hệ ethylacetat: methanol (20:1) để tách các kháng sinh trên cột tốt hơn.
Khảo sát các nghiên cứu trước, thêm một dung môi nữa là n-hexan vào hệ ethylacetat: methanol (20:1), tiến hành khảo sát để tìm tỷ lệ n-hexan thích hợp.
Bảng 3.11. Tỷ lệ các thành phần hệ dung môi ethylacetat: methanol: n- hexan
Hệ dung môi Tỷ lệ các thành phần
Etylacetat Methanol n-hexan
1.1 20 1 1
1.2 20 1 2
37
Tiến hành sắc ký lớp mỏng kháng sinh P1 với các hệ dung môi 1.1, 1.2, 1.3 thu được kết quả trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả SKLM với các hệ dung môi Ethylacetat: methanol: n- hexan
Hệ dung môi Rf vết 1 Rf vết 2
1.1 0,68 0,52
1.2 0,66 0,53
1.3 0,33 0,38
Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy, hệ 1.1 so với hệ ethylacetat: methanol (20:1) chỉ có thêm 1 lượng rất nhỏ n-hexan nhưng kết quả tách cải thiện nhiều, còn hệ 1.2 có tác dụng kéo dài khoảng cách giữa 2 vết kháng sinh nhưng không khác hệ 1.1 nhiều thậm chí còn kém hơn hệ 1.1. Hệ 1.3 chứa nhiều n-hexan nhất thì dung môi không kéo được vết kháng sinh P1 lên , các vết kháng sinh gần như không tách nhau. Do đó, chúng tôi lựa chọn hệ 1.1 để tiến hành tinh chế kháng sinh P1.