* Mục đích:
Tiếp tục tinh chế kháng sinh P1 nhằm thu được thành phần kháng sinh tinh khiết hơn.
* Tiến hành và kết quả:
Kháng sinh P1 được chạy cột Silicagel bằng hệ dung môi ethylacetat: methanol: n-hexan với tỷ lệ 20:1:1 đến khi dung môi chảy ra chỉ còn màu vàng nhạt thì thu được 30 phân đoạn mỗi phân đoạn 3ml.
Tiến hành thử hoạt tính kháng sinh từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc với VSV kiểm định là vi khuẩn P. mirabilis. Kết quả của thí nghiệm này được thể hiện trên bảng 3.13.
38
Bảng 3.13. Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau tinh chế lần 2. Phân đoạn D(mm) s Phân đoạn D(mm) s
1 0,00 0,00 16 21,76 0,44 2 11,13 0,82 17 20,57 0,40 3 11,95 0,74 18 18,86 0,55 4 16,37 0,48 19 17,88 0,65 5 18,06 0,82 20 16,77 0,30 6 18,83 0,56 21 15,52 0,53 7 19,31 0,56 22 12,91 0,39 8 20,53 0,52 23 10,02 0,19 9 21,64 0,43 24 7,39 0,50 10 22,53 0,38 25 5,97 1,53 11 22,84 0,17 26 5,87 0,68 12 23,25 0,89 27 0,00 0,00 13 23,46 0,70 28 0,00 0,00 14 22,24 0,89 29 0,00 0,00 15 21,78 0,78 30 0,00 0,00 Các phân đoạn có hoạt tính kháng sinh được mang chạy sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi 1.1. Kết quả này được thể hiện trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả SKLM các phân đoạn sau tinh chế lần thứ hai
Phân đoạn Số vết Rf vết 1 Rf vết 2
2-7 1 vết 0.68 -
8-16 2 vết 0,68 0,53
39
* Nhận xét
Bảng 3.13 cho thấy phân đoạn đầu tiên và bốn phân đoạn cuối cùng không có HTKS. Các phân đoạn còn lại có HTKS khá cao, đặc biệt là các phân đoạn từ 4 đến 20.
Bảng 3.14. cho thấy các phân đoạn từ 2 đến 7 là cùng 1 kháng sinh có Rf=0,68. Các phân đoạn từ 17 đến 26 cho cùng 1 chất kháng sinh có Rf=0,53. Trong các phân đoạn từ 8 đến 16 chứa 2 kháng sinh nhưng chưa tách riêng được.
Do đó, tiến hành gộp các phân đoạn từ 2 đến 7, cất quay chân không ở nhiệt độ 500C đến hết dung môi, kết tinh thu được 0,0423g kháng sinh có Rf=0,68 (từ đây gọi là kháng sinh X1).
Gộp các phân đoạn từ 17 đến 26, cất quay chân không ở nhiệt độ 500 C đến hết dung môi, kết tinh thu được 0,0532g kháng sinh có Rf=0,53 (từ đây gọi là kháng sinh X2).
Thử SKLM kháng sinh X1 và X2 với 4 hệ dung môi khác nhau thì đều thấy 1 vết tròn, gọn, không kéo đuôi. Như vậy, X1 và X2 là chất tinh khiết cao.
Hiệu suất tinh chế kháng sinh X1 từ kháng sinh P1 là:
HX1= x 100% = 8,71 %
Hiệu suất tinh chế kháng sinh X2 từ kháng sinh P1 là:
HX2=
x 100% = 10,95 %
Gộp phân đoạn từ 8 đến 16, cất quay chân không ở nhiệt độ 500C đến hết dung môi, kết tinh thu được 0,2068g hỗn hợp kháng sinh X1 và X2 ( gọi là P2). Như vậy, lượng kháng sinh trong các phân đoạn từ 8 đến 16 là rất lớn, cần tìm được dung môi tốt hơn để tách kháng sinh X1 và X2 từ hỗn hợp kháng sinh P2 này.