Tiến hành cải tạo giống qua sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến UV, chúng tôi đã lựa chọn được 9 dạng chủng, biến chủng tốt để lựa chọn chủng lên men tốt nhất, đó là: SL.02, SL.09, SL.14, ĐB1.04, ĐB1.13, ĐB1.30, ĐB2.02, ĐB2.10, ĐB2.25. Tiến hành lên men riêng biệt và so sánh hoạt tính kháng sinh của các dịch lọc dịch lên men thì thấy biến chủng ĐB2.02 lên men chìm tốt nhất. Kết quả này là hợp lý bởi vì ĐB2.02 là biến chủng có HTKS cao nhất thu được sau đột biến lần hai.
Nâng cao khả năng lên men của chủng / biến chủng bằng cách thêm vào môi trường MT1dt một lượng cao nấm men. Kết quả thu được môi trường lên men tối thích là MT1dt.2 (thêm 0,5% cao nấm men vào MT1dt), dịch lên men có hoạt tính kháng sinh cao hơn dịch lên men của MT1dt ( hoạt tính kháng sinh dịch lên men MT1dt.2 bằng 107,16% MT1dt).
Lượng kháng sinh trong dịch lên men thu được là 0.1218 g/l, so sánh với nghiên cứu trước lượng kháng sinh trong dịch lên men chỉ đạt 0,1033 g/l [7]. Như vậy, quá trình chọn lọc, cải tạo giống, thay đổi môi trường nuôi cấy đã làm tăng hiệu quả sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 173.113 so với nghiên cứu trước.
Kháng sinh thô thu được sau cất quay là một hỗn hợp nhiều chất kháng sinh và các tạp chất khác (có thể là chất màu,…). Do đó, việc tách và tinh chế kháng sinh có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu kháng sinh.
Trong đề tài này, kháng sinh được tinh chế ba lần. Lần thứ nhất, sử dụng hệ dung môi butylacetat: aceton: triethylamin (1:2:1) để tiến hành sắc ký cột. Hệ này có tác dụng giữ lại một số tạp chất (có thể là chất màu trong kháng sinh
51
thô, do trước chạy cột kháng sinh thô có màu đỏ nâu, sau chạy cột có màu đỏ tươi). Tuy nhiên, các phân đoạn kháng sinh P1 sau khi sắc ký cột, mặc dù các kháng sinh có tách nhau trên SKLM nhưng lại không tách nhau trên sắc ký cột ( mỗi phân đoạn đều có ít nhất 2 chất kháng sinh). Như vậy, cần phải tìm hệ dung môi khác để có thể tách riêng được các thành phần kháng sinh trên sắc ký cột.
Lần tinh chế thứ hai sử dụng hệ dung môi ethylacetat: methanol: n- hexan ( 20:1:1) để sắc ký cột tách các thành phần khác nhau của hỗn hợp P1.
Nhìn vào bảng kết quả 3.13 và 3.14 có thể thấy các phân đoạn từ 2 đến 7, từ 17 đến 26 cho ta được 2 kháng sinh tinh khiết là X1 và X2 có hoạt tính kháng sinh khá cao. Tuy nhiên, các phân đoạn xen phủ giữa chất X1 và X2 là các phân đoạn 8 đến 16 cũng có hoạt tính kháng sinh rất cao (khi quan sát bằng mắt thường thì các phân đoạn 2 chất này có màu đỏ cam rất đậm), cất loại dung môi thu được 0.2068g. Như vậy, phân đoạn hỗn hợp từ 8 đến 16 còn chứa một lượng lượng kháng sinh tinh khiết rất lớn mà hệ ethylacetat: methanol: n-hexan ( 20:1:1) chưa tách được. Do đó, chúng tôi đã khảo sát để tìm ra hệ dung môi có khả năng tách riêng được kháng sinh X1 và X2 tốt hơn.
Thay đổi methanol trong hệ dung môi trên bằng các alcol có mạch dài hơn nhằm tăng thời gian lưu trên cột của các chất, do đó dễ tách riêng các chất ra hơn. Khảo sát các hệ, thu được hệ dung môi ethylacetat: ethanol: n-hexan ( 20:1:1) có khả năng tách các chất tốt hơn hệ sử dụng methanol. Cụ thể, hiệu suất lần chạy cột thứ 3 của chất kháng sinh tinh khiết 1, và 2 lần lượt là 15,52% và 20,52%, tăng cao hơn so với hiệu suất chạy cột lần 2 của chất 1, và 2 là 8,71% và 10,95%. Các kháng sinh tách ra từ lần tinh chế 3 cũng chính là các kháng sinh tách ra từ lần tinh chế 2. Gộp lần lượt các kháng sinh của hai lần tinh chế thu được hai kháng sinh tinh khiết KS1, và KS2
52
Hiệu suất tinh chế sau cùng của các kháng sinh KS1 và KS2 lần lượt là
8,15% và 10,47%. So sánh với nghiên cứu trước, hiệu suất tinh chế sau cùng của kháng sinh chính là 33,48% tuy nhiên, độ tinh khiết của kháng sinh thu được chưa cao. Trong nghiên cứu này, mặc dù hiệu suất tinh chế chưa bằng nghiên cứu trước, tuy nhiên độ tinh khiết cao hơn do đó các nghiên cứu về sau có độ chính xác cao hơn, nhất là trong việc xác định cấu trúc kháng sinh thu được.
Như vậy, sau 3 lần chạy cột tinh chế thu được hai chất tinh khiết là KS1 và KS2 và quá trình nghiên cứu cũng cho thấy, chúng có vai trò tương đương nhau trong việc tạo thành hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn này, không thể phân rõ đâu là chất chính, đâu là chất phụ.