3.3.1. Kết quả đo độ nóng chảy
Thí nghiệm đo độ nóng chảy của kháng sinh KS1 và KS2 được thực hiện tại phòng Kỹ thuật tổng hợp Hóa dược- bộ môn Công nghiệp Dược, trường Đại học Dược Hà Nội. Kết quả như sau:
Kháng sinh KS1 nóng chảy ở 143-145 oC. Kháng sinh KS2 nóng chảy ở 231-236 oC.
3.3.2. Kết quả phổ tử ngoại
Tiến hành đo phổ tử ngoại của kháng sinh KS1 và KS2 tại khoa Hóa lý- Đại học Dược Hà Nội. Kết quả phổ UV cho thấy kháng sinh KS1 có 3 đỉnh hấp thụ ở bước sóng λ1 = 444 nm, λ2 = 239,5 nm và λ3= 203 nm.
44
Kháng sinh KS2 có 2 đỉnh hấp thụ ở bước sóng λ1 = 443,5 nm và bước sóng λ2 = 204 nm.
Hình ảnh phổ UV của KS1 và KS2 được thể hiện trong phụ lục (Hình P1, P2).
3.3.3. Kết quả phổ hồng ngoại
Phổ IR của 2 kháng sinh KS1 và KS2 được đo tại viện Hóa học bằng phương pháp viên nén KBr ở vùng bước sóng từ 4000 – 500 cm-1.
Kết quả cho thấy:
Phổ IR của chất KS1 có 12 bước sóng hấp thụ cực đại là 3366,32 cm-1 , 2931,99 cm-1, 1731,56 cm-1, 1655,90 cm-1, 1577,44 cm-1, 1462,55 cm-1, 1266,39 cm-1, 1101,06 cm-1, 980,57 cm-1, 733,98 cm-1, 588,26 cm-1 và 479,13 cm-1.
Phổ IR của chất KS2 có 14 bước sóng hấp thụ cực đại là 3393,74 cm-1 , 3266,85 cm-1, 2963,72 cm-1, 1744,99 cm-1, 1644,30 cm-1, 1575,31 cm-1, 1478,20 cm-1, 1301,87 cm-1, 1197,10 cm-1, 1120,93 cm-1, 813,78 cm-1, 627,23 cm-1, 545,45 cm-1, 479,01 cm-1 .
Bảng 3.19: Biện giải các nhóm chức của KS1 từ phổ IR
Bước sóng (cm-1)
Nhóm chức đặc trưng Bước sóng (cm-1)
Nhóm chức đặc trưng
3366,32 –OH trong phenol, hoặc carboxylic acid.
-N-H trong amin hoặc amid.
1266,39 -C-O trong alcol, ether, ester, carboxylic, anhydrid. -C-F.
S=O trong sulfon, sulfunyl chlorid, sulfat, sufonamid. 2931,99 - C-H của alkan. 1101,06 -C-O trong alcol, ether,
ester, carboxylic, anhydrid. -C-F.
45
S=O trong sulfoe, sulfunyl chlorid, sulfate, sufonamid. C-N của amin
1731,56 -CO của aldehyd, hoặc ester. 980,57 -CH trong alken. 1655,90 -CO của amid hoặc C=N của
imin hoặc oxim. C=C của alken.
733,98 -C-Cl.
-C-H trong alken, hoặc nhân thơm.
1577,44 - N-H trong amin hoặc amid. 588,26 -C-Br hoặc C-I. 1462,55 - CH3 trong alkan. 479,13 -C-Br hoặc C-I.
Bảng 3.20: Biện giải các nhóm chức của KS2 từ phổ IR
Bước sóng (cm-1) Nhóm chức đặc trưng Bước sóng (cm-1) Nhóm chức đặc trưng 3393,74 3266,85 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
–OH trong phenol, hoặc carboxylic acid.
-N-H trong amin hoặc amid .
1301,87 -CN trong amin.
S=O trong sulfon, sulfunyl chlorid, sulfat, sufonamid. C-F.
2963,72 -C-H của alkan. 1197,10 1120,93
-C-O trong alcol, ether, ester, carboxylic, anhydrid.
-C-N của amin.
S=O trong sulfon, sulfunyl chlorid, sulfat, sufonamid
1744,99 -CO của ester 813,78 -CH trong alken hoặc nhân thơm.
46 1644,30 -CO của amide hoặc C=N
của imine hoặc oxime C=C của alken
627,23 C-Cl
1575,31 -N-H trong amin hoặc amid 545,45 C-X (X= Br, I)
1478,20 C=C trong nhân thơm 479,01 C-X (X= Br, I)
* Nhận xét: Như vậy có thể sơ bộ dự đoán kháng sinh KS1, KS2 có thể có các nhóm chức amin, amid, acid carboxylic, aldehyd, este, có nhân thơm, các muối của amin bậc 2, bậc 3....Hình ảnh phổ IR của KS1 và KS2 được thể hiện trong phụ lục ( Hình P3, P4).
3.3.4. Kết quả đo phổ khối
Tiến hành đo phổ khối của KS1 và KS2 tại Viện Hóa học. Kết quả cho thấy khối lượng phân tử dự kiến của KS1 và KS2 lần lượt là: 1269,45 đvC và
1255,44 đvC. Hình ảnh phổ MS của hai chất này được thể hiện trong phụ lục (Hình P5, P6).
3.3.5. Kết quả đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Tiến hànhh đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân đối với mẫu KS2, gồm có: 1 H NMR, 13C NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC.
Phổ 13
C-NMR xuất hiện 13 tín hiệu tại vùng trường thấp từ 160-180 ppm tại δ 166,32; 166,485; 166,522; 166,601; 167,572; 167,671; 168,624; 169,046; 173,256; 173,279; 173,317; 173,652; 179,063. Trong đó có 12 tín hiệu đầu điển hình cho sự có mặt của 12 nhóm C=O trong liên kết peptid –N-C=O, và một nhóm C=O trong vòng tại δ 179,063
47
Xuất hiện 12 tín hiệu của 12 nhóm methyl tại δ 39,216; 39,144; 34,956; 34,889; 19,093; 19,070; 19,029; 18,985; 17,716; 17,313; 15,025; 7,767. Trong đó, 4 tín hiệu tại δ 39,216; 39,144; 34,956; 34,889 dịch chuyển về trường thấp hơn so với tín hiệu nhóm methyl thông thường=> điển hình cho 4 nhóm methyl gắn trực tiếp với nguyên tử Nitơ.
Cũng từ phổ 13
C-NMR , phổ DEPT 135 xuất hiện tín hiệu của 7 nhóm – CH2 tại δ 22,838; 23,005; 30,981; 31,226; 47,350; 47,590; và 51,374. Trong đó ngoài các tín hiệu δ 22,838; 23,005, còn lại 5 tín hiệu đều dịch chuyển mạnh về phía trường thấp hơn các nhóm methylene thông thường. Điều này chứng tỏ 5 nhóm methylene này đều có liên kết với các nhóm hút điện tử mạnh như Nitơ và C=O.
Phổ 13
C-NMR , phổ DEPT 90 xuất hiện tín hiệu của 16 nhóm –CH- tại δ 26,945; 27,008; 31,562; 31,804; 54,818; 55,171; 56,315; 56,554; 58,758; 58,918; 71,184; 71,384; 74,985; 75,053; 125,663; 130,276. Trong đó, ngoài 4 tín hiệu tại δ 26,945; 27,008; 31,562; 31,804 thì các tín hiệu khác đều bị dịch chuyển mạnh về trường thấp hơn các nhóm –CH- thông thường, chứng tỏ các nhóm này nằm trong vòng thơm.
Đặc biệt phổ 13
C-NMR và 1H cho thấy các tín hiệu của khung phenoxazone tại δC=O : 179,063; δCH3 : 15,025 và 7,767; δCH : 130,276, 125,663; (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
δC : 147,496; 145,845; 145,067; 140,482; 132,606, 129,122; 127,660; 113,527; 101,800. Phổ 1H cho hai tín hiệu δH: 7,607; 7,353, dựa vào tương tác trên phổ HSQC có thể kết luận hai tín hiệu đó là tín hiệu của 2 proton olefin của khung phenoxazone tại vị trí octo của khung (C7 và C8).
Dưới đây là bảng so sánh dữ kiện phổ NMR của KS2 với khung phenoxazone của phân tử actinomycin D [16, 17, 20].
48
Bảng 3.21. So sánh phổ NMR của KS2 với khung phenoxazone của actinomycin D Vị trí Actinomycin D KS2 1 101,6 101,800 2 146,0 145,845 3 179,1 179,063 4 113,5 113,527 4a 145,1 145,047 5a 140,5 140,482 6 127,5 127,660 7 130,2 130,276 8 125,9 125,663 9 132,6 132,606 9a 129,1 129,122 -CH3 ở vị trí 4 7,7 7,767 -CH3 ở vị trí 6 15,0 15,025 C=O ở vị trí 3 179,1 179,063 H+ vị trí 7 7,6 7,607 H+ vị trí 8 7,3 7,353
Như vậy, có thể kết luận, kháng sinh KS2 phân lập từ xạ khuẩn
Streptomyces 173.113 là kháng sinh thuộc nhóm actinomycin.
Kết quả đo phổ NMR được thể hiện trong phần phụ lục ( Từ hình P7 đến hình P12).
49
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN 4.1. Chọn lọc và cải tạo giống xạ khuẩn
Từ nghiên cứu trước [7], sau khi trải qua bước sàng lọc ngẫu nhiên và 3 lần đột biến bằng UV và hóa chất thì hoạt tính kháng sinh của chủng
Streptomyces 173.113 tăng rõ rệt. Lựa chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao
nhất từ nghiên cứu trước, tiếp tục tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến bằng UV để tăng hoạt tính kháng sinh. Mặc dù ở nghiên cứu trước, chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất có đường kính vòng vô khuẩn lên tới 28,19 mm (VSV kiểm định là S. aureus), và 26,12 mm (VSV kiểm định là P. mirabilis), còn ở nghiên cứu này đường kính vòng vô khuẩn của chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất sau sàng lọc ngẫu nhiên và 2 lần đột biến chỉ đạt có 26,03 mm (VSV kiểm định là S. aureus), và 24,94 mm (VSV kiểm định là P. mirabilis) nhưng so với mẫu chứng thì vẫn cao hơn ( điều này có thể do điều kiện nhiệt độ, độ ẩm lúc lúc tiến hành nuôi cấy khác nhau, ảnh hưởng tới đường kính vòng vô khuẩn).
Qua lần đột biến bằng ánh sáng UV lần thứ nhất, với độ sống sót là 0,73% thì đa phần các biến chủng thu được có hoạt tính cao hơn so với mẫu chứng (đột biến dương). Trong đó, cao nhất là biến chủng ĐB1.13 với hoạt tính kháng sinh bằng 113,26% so với mẫu chứng.
Tiếp tục đột biến biến chủng ĐB1.13 bằng ánh sáng UV lần thứ hai, độ sống sót là 0,58% thì vẫn thu được đột biến dương. Cao nhất là biến chủng ĐB2.02 có hoạt tính kháng sinh bằng 110,26% so với mẫu chứng.
Như vậy, kết quả 2 lần đột biến bằng ánh sáng UV làm tăng hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc (hoạt tính kháng sinh sau 2 lần đột biến bằng 124,88% so với mẫu ban đầu).
Do giới hạn về thời gian, nên chúng tôi chưa thử tiến hành đột biến bằng tác nhân khác để đánh giá sự thay đổi hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn. Vì vậy,
50
chúng tôi sẽ đề xuất thay đổi tác nhân đột biến cho nghiên cứu sau này (có thể dùng tác nhân hóa học).
4.2. Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tối thích
Tiến hành cải tạo giống qua sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến UV, chúng tôi đã lựa chọn được 9 dạng chủng, biến chủng tốt để lựa chọn chủng lên men tốt nhất, đó là: SL.02, SL.09, SL.14, ĐB1.04, ĐB1.13, ĐB1.30, ĐB2.02, ĐB2.10, ĐB2.25. Tiến hành lên men riêng biệt và so sánh hoạt tính kháng sinh của các dịch lọc dịch lên men thì thấy biến chủng ĐB2.02 lên men chìm tốt nhất. Kết quả này là hợp lý bởi vì ĐB2.02 là biến chủng có HTKS cao nhất thu được sau đột biến lần hai.
Nâng cao khả năng lên men của chủng / biến chủng bằng cách thêm vào môi trường MT1dt một lượng cao nấm men. Kết quả thu được môi trường lên men tối thích là MT1dt.2 (thêm 0,5% cao nấm men vào MT1dt), dịch lên men có hoạt tính kháng sinh cao hơn dịch lên men của MT1dt ( hoạt tính kháng sinh dịch lên men MT1dt.2 bằng 107,16% MT1dt).
Lượng kháng sinh trong dịch lên men thu được là 0.1218 g/l, so sánh với nghiên cứu trước lượng kháng sinh trong dịch lên men chỉ đạt 0,1033 g/l [7]. Như vậy, quá trình chọn lọc, cải tạo giống, thay đổi môi trường nuôi cấy đã làm tăng hiệu quả sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 173.113 so với nghiên cứu trước.
Kháng sinh thô thu được sau cất quay là một hỗn hợp nhiều chất kháng sinh và các tạp chất khác (có thể là chất màu,…). Do đó, việc tách và tinh chế kháng sinh có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu kháng sinh.
Trong đề tài này, kháng sinh được tinh chế ba lần. Lần thứ nhất, sử dụng hệ dung môi butylacetat: aceton: triethylamin (1:2:1) để tiến hành sắc ký cột. Hệ này có tác dụng giữ lại một số tạp chất (có thể là chất màu trong kháng sinh
51
thô, do trước chạy cột kháng sinh thô có màu đỏ nâu, sau chạy cột có màu đỏ tươi). Tuy nhiên, các phân đoạn kháng sinh P1 sau khi sắc ký cột, mặc dù các kháng sinh có tách nhau trên SKLM nhưng lại không tách nhau trên sắc ký cột ( mỗi phân đoạn đều có ít nhất 2 chất kháng sinh). Như vậy, cần phải tìm hệ dung môi khác để có thể tách riêng được các thành phần kháng sinh trên sắc ký cột.
Lần tinh chế thứ hai sử dụng hệ dung môi ethylacetat: methanol: n- hexan ( 20:1:1) để sắc ký cột tách các thành phần khác nhau của hỗn hợp P1.
Nhìn vào bảng kết quả 3.13 và 3.14 có thể thấy các phân đoạn từ 2 đến 7, từ 17 đến 26 cho ta được 2 kháng sinh tinh khiết là X1 và X2 có hoạt tính kháng sinh khá cao. Tuy nhiên, các phân đoạn xen phủ giữa chất X1 và X2 là các phân đoạn 8 đến 16 cũng có hoạt tính kháng sinh rất cao (khi quan sát bằng mắt thường thì các phân đoạn 2 chất này có màu đỏ cam rất đậm), cất loại dung môi thu được 0.2068g. Như vậy, phân đoạn hỗn hợp từ 8 đến 16 còn chứa một lượng lượng kháng sinh tinh khiết rất lớn mà hệ ethylacetat: methanol: n-hexan ( 20:1:1) chưa tách được. Do đó, chúng tôi đã khảo sát để tìm ra hệ dung môi có khả năng tách riêng được kháng sinh X1 và X2 tốt hơn.
Thay đổi methanol trong hệ dung môi trên bằng các alcol có mạch dài hơn nhằm tăng thời gian lưu trên cột của các chất, do đó dễ tách riêng các chất ra hơn. Khảo sát các hệ, thu được hệ dung môi ethylacetat: ethanol: n-hexan ( 20:1:1) có khả năng tách các chất tốt hơn hệ sử dụng methanol. Cụ thể, hiệu suất lần chạy cột thứ 3 của chất kháng sinh tinh khiết 1, và 2 lần lượt là 15,52% và 20,52%, tăng cao hơn so với hiệu suất chạy cột lần 2 của chất 1, và 2 là 8,71% và 10,95%. Các kháng sinh tách ra từ lần tinh chế 3 cũng chính là các kháng sinh tách ra từ lần tinh chế 2. Gộp lần lượt các kháng sinh của hai lần tinh chế thu được hai kháng sinh tinh khiết KS1, và KS2
52 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiệu suất tinh chế sau cùng của các kháng sinh KS1 và KS2 lần lượt là
8,15% và 10,47%. So sánh với nghiên cứu trước, hiệu suất tinh chế sau cùng của kháng sinh chính là 33,48% tuy nhiên, độ tinh khiết của kháng sinh thu được chưa cao. Trong nghiên cứu này, mặc dù hiệu suất tinh chế chưa bằng nghiên cứu trước, tuy nhiên độ tinh khiết cao hơn do đó các nghiên cứu về sau có độ chính xác cao hơn, nhất là trong việc xác định cấu trúc kháng sinh thu được.
Như vậy, sau 3 lần chạy cột tinh chế thu được hai chất tinh khiết là KS1 và KS2 và quá trình nghiên cứu cũng cho thấy, chúng có vai trò tương đương nhau trong việc tạo thành hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn này, không thể phân rõ đâu là chất chính, đâu là chất phụ.
4.3. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
* Kết quả đo phổ UV: cho thấy KS1 có 3 đỉnh hấp thụ chính tương ứng với 3 bước sóng λ1 = 444 nm, λ2 = 239,5 nm và λ3= 203 nm. KS2 có 2 đỉnh hấp thụ chính tương ứng với 2 bước sóng λmax là λ1 = 443,5 nm và λ2 = 204 nm.
Các đỉnh hấp thụ này tương ứng với sự chuyển dịch điện tử từ n lên π* . Trong đó n là cặp điện tử tự do (không liên kết) ở các dị nguyên tử O, N, S, halogen. Như vậy kháng sinh nghiên cứu là hợp chất có chứa điện tử n và liên kết π. Hay nói cách khác trong cấu trúc kháng sinh có thể có nhân thơm, nối đôi liên hợp, có chứa dị tố, hoặc kết hợp các yếu tố trên.
* Kết quả đo phổ IR: Phổ IR của chất KS1 và KS2 cho phép dự đoán các nhóm chức đặc trưng trong cấu trúc hóa học của kháng sinh KS1 và KS2.
Như vậy, từ bảng 3.19 và bảng 3.20 có thể sơ bộ dự đoán kháng sinh KS1 và KS2 có thể có các nhóm chức amin, amid, acid carboxylic, aldehyd, este, có nhân thơm, các muối của amin bậc 2, bậc 3....
Tuy nhiên, nhìn vào kết quả phổ IR có thể thấy cấu trúc hóa học của KS1 và KS2 hết sức phức tạp với nhiều nhóm chức khác nhau, do đó cần tiến hành đo
53
thêm các phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định được chính xác cấu trúc của KS1 và KS2
* Kết quả đo phổ NMR và MS:
Từ hình ảnh các phổ NMR của chất KS2 cho thấy cấu trúc của kháng sinh này rất phức tạp. Do hạn chế về trình độ và thời gian, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ biện giải được một số nhóm chức đặc trưng của KS2 mà chưa biện giải được cấu trúc đầy đủ của KS2.
Từ quá trình biện giải cho thấy cấu trúc KS2 có mặt của khung phenoxazone, một khung đặc trưng cho cấu trúc các kháng sinh thuộc nhóm actinomycin.
Như vậy, có thể kết luận, kháng sinh KS2 phân lập từ xạ khuẩn
54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau một thời gian nghiên cứu, chúng tôi đã cơ bản hoàn thành được mục tiêu ban đầu của luận văn. Các kết luận cụ thể như sau:
- Qua 2 lần đột biến bằng UV thì hoạt tính kháng sinh của Streptomyces
173.113 tăng lên nhiều ( hoạt tính kháng sinh sau đột biến bằng 124,88% trước