- Vacxin truyền thống:
CHƯƠNG IỊ NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nội dung nghiên cứu
- Tình hình chăn nuôi gia cầm trên ựịa bàn thành phố Hà Nộị
- đánh giá diễn biến dịch cúm gia cầm trên ựịa bàn thành phố Hà Nội giai ựoạn 2003 Ờ 2012.
- Hiện trạng buôn bán gia cầm ở một số chợ ựầu mối trên ựịa bàn thành phố Hà Nộị
- Giám sát sự lưu hành của vi rút cúm A/H5N1 trên ựàn gia cầm buôn bán tại các chợ ựầu mối trên ựịa bàn thành phố Hà Nộị
2.2. địa ựiểm nghiên cứu
Tại các chợ buôn bán gia cầm lớn trên ựịa bàn Thành phố Hà Nội : Chợ gia cầm Hà Vĩ Ờ Huyện Thường Tắn; Chợ gia cầm Bắc Thăng Long Ờ Huyện đông Anh; Chợ Thị trấn Chúc Sơn Ờ Huyện Chương Mỹ; Chợ Săn Ờ Huyện Thạch Thất.
Các xét nghiệm ựược thực hiện tại Cơ quan Thú y Vùng I - Cục Thú ỵ
2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1.1. Nguyên liệu
Mẫu swab từ gia cầm ựược lấy theo công văn hướng dẫn của chương trình giám sát cúm gia cầm của Dự án VAHIP.
2.3.1.2. Dụng cụ và hóa chất
* Dụng cụ
- Máy Vortex, máy li tâm Spindown, buồng cấy vô trùng Class II, tủ lạnh âm, máy ly tâm lạnh, máy Realtime PCR, hệ thống bơm hút chân không Quivacệ.
Lepheidệ Smart Cycle, Sunnyvale, CA), micropipet các cỡ, ống eppendorf, ựầu côn, găng taỵ
* Hóa chất và các chế phẩm sinh học - Nước cất vô trùng (RNase free H2O). - Dung dịch rửa RW1 buffer.
- Dung dịch rửa RPE buffer. - Quiagenệbuffer RLT có β-MẸ - Cồn Ethanol 70%.
- RNA ựối chứng dương tắnh M, H5 và H7 (ựược NVSL cung cấp). - Kắt chiết tách Qiagenệ Rneasy Extraction.
- Kắt RT/PCR One-Step RT/PCR với Platinium taq DNA polymerasẹ - Primer và probe cho H5N1
- RNase Inhibitor (13,3 units/ộl); MgCl2; ựệm TE PH 8.0, 1 x. - β-Mercaptoethanol (β-ME).
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, phương pháp ựiều tra hồi cứu và ựiều tra thực ựịa ựã ựược sử dụng ựể thu thập, tổng hợp thông tin từ người chăn nuôi, từ các Trạm Thú y huyện và Chi cục Thú y Hà Nội về tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến dịch cúm gia cầm và hiện trạng buôn bán gia cầm ở một số chợ ựầu mối trên ựịa bàn thành phố Hà Nộị
Phương pháp hồi cứu cũng ựã ựược sử dụng ựể tổng hợp thông tin về kết quả giám sát sự lưu hành của vi rút cúm A/H5N1 trên ựịa bàn Hà Nộị
Phương pháp phân tắch dịch tễ học ựược dùng ựể ựánh giá một số yếu tố nguy cơ làm phát sinh dịch cúm gia cầm trên ựịa bàn thành phố Hà Nộị
Xác ựịnh sự lưu hành của vi rút cúm A/H5N1 bằng phương pháp Real- time RT-PCR.
2.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu nghiên cứu ựược lấy tại 04 chợ của 04 huyện: Chợ Hà Vĩ thuộc huyện Thường Tắn, chợ Bắc Thăng Long huyện đông Anh, chợ Thị trấn Chúc Sơn huyện Chương Mỹ, chợ Săn huyện Thạch Thất.
Số lượng mẫu ựược lấy theo chương trình giám sát sự lưu hành vi rút cúm A/H5N1 hàng năm của Dự án VAHIP, cụ thể: Chợ Hà Vĩ: 60 mẫu swab gộp/tháng; các chợ còn lại 12 mẫu swab gộp/ tháng. Tổng cộng 96 mẫu swab gộp/tháng.
* Phương pháp lấy mẫu swab
Dùng tăm bông vô trùng ngoáy lấy dịch hầu họng hoặc dịch ổ nhớp của từng con gia cầm cần xét nghiệm. Gộp 5 tăm bông ựã lấy dịch hầu họng của 5 con gia cầm lại thành 1 mẫu hoặc gộp 5 tăm bông ựã lấy dịch ổ nhớp của 5 con gia cầm lại thành 1 mẫu (không ựể trộn lẫn giữa dịch ngoáy hầu họng và dịch ngoáy ổ nhớp). Các tăm bông có dịch ngoáy ựựng trong ống có chứa dung dịch bảo quản.
* Phương pháp bảo quản mẫu
Bệnh phẩm phải ựặt trong hộp bảo quản có nhiệt ựộ từ 20C ựến 80C trong quá trình vận chuyển. Phiếu gửi bệnh phẩm, danh sách mẫu kèm theo phải ghi rõ ràng, ựầy ựủ các thông tin cung cấp cho phòng xét nghiệm và phải ựựng trong một túi nilon khác tách biệt với mẫu bệnh phẩm, tránh gây ướt làm thông tin không chắnh xác.
Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy gửi về Cơ quan Thú y vùng I Ờ Cục thú y xét nghiệm.
2.3.2.2. Phương pháp Real-time RT-PCR phát hiện vi rút cúm gia cầm
* Chiết tách ARN tổng số
Tách chiết ARN tổng số từ mẫu dịch ngoáy (swab) bằng Qiagenệ RNeasy Mini Kit. Các bước cụ thể như sau:
- Lắc mạnh (bằng máy Vortex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lượng 500ộl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫụ
- Cho 500ộl Qiagenệ buffer RLT có β-ME vào ống ly tâm trên. Lắc ựều trên máy Vortex.
- Ly tâm (bằng máy Spindown) ựể dịch bệnh phẩm ựọng trên nắp trôi xuống ựáy ống. Cho 500ộl cồn ETOH 70% (ethanol), lắc mạnh bằng Vortex. Ly tâm mẫu ựã bị dung giải trong 5 phút, tốc ựộ 5000xg ở nhiệt ựộ phòng.
- Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasyệQiagen ựã ghi sẵn ký hiệu mẫụ Ly tâm trong 15 giây tốc ựộ ≥ 8000xg ở nhiệt ựộ phòng. Kiểm tra dịch mẫu ựã thấm qua cột lọc chưạ Lặp lại bước này cho toàn bộ mẫu ựã qua cột lọc.
Ngoài ra có thể dùng ống hút Quivacệ ựể hút dịch mẫu và rửa thông qua cột thu mẫụ Phương pháp này làm tăng hiệu quả và không phải ly tâm cột lọc.
- Bổ sung 700ộl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasyệQiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥ 8000 xg, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc.
- Cho 500ộl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥ 8000xg, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
- Lặp lại bước trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2ml vào cột lọc.
- Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc ựộ tối ựa (khoảng 12.000 vòng/phút), bỏ ống thu mẫụ
- đặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml ựã ựược ghi sẵn ký hiệu mẫụ Cho 50ộl RNase free vào cột lọc. Chú ý không ựược chạm ựầu pipet vào mặt thạch Silica trong cột lọc. Ủ ở nhiệt ựộ phòng trong ắt nhất 1 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở 10.000 vòng/phút. Bỏ cột lọc RNeasyệ.
- Bảo quản mẫu ARN thu ựược ở 4oC trong thời gian ngắn trước khi làm Real-time RT-PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở -20oC hoặc
nhiệt ựộ thấp hơn.
* Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR - Primer và probe:
Sử dụng các primer và probe thiết kế ựặc hiệu cho vi rút cúm A/H5N1, cụ thể như sau:
đầu Gen Primer/
Probe Chuỗi nucleotide (5Ỗ-3Ỗ) 5Ỗ 3Ỗ
Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG Xuôi CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC M Ngược AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA FAM BHQ1 Probe TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA Xuôi ACGTATGACTACCCGCAGTATTCA H5 Ngược AGACCAGCTACCATGATTGC HEX BHQ1 Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC Xuôi TGGACTAGTGGGAGCAGCAT N1 Ngược TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC FAM BHQ1