NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ựổi ựại thể cần tiến hành làm tiêu bản ựể xác ựịnh bệnh tắch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin Ờ Eosin (HE). Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
+ Tẩy nước làm trong
Sau khi cố ựịnh bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7 Ờ 10 ngày, lấy bệnh phẩm ra khỏi dung dịch formol 10% rồi ựem rửa nước 24h dưới dòng nước chảy nhẹ ựể trôi hết formol.
Khử nước: bệnh phẩm rửa nước xong, thấm nhẹ trên giấy lọc rồi cho vào hệ thống cồn Ethylic với thời gian như sau:
Cốc 1: cồn 700 trong 3 giờ. Cốc 2: cồn 900 trong 3 giờ. Cốc 3: cồn 1000 trong 4 giờ. Cốc 4: cồn 1000 trong 12 giờ
Làm trong: lấy bệnh phẩm ra khỏi hệ thống cồn thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho vào hệ thống 3 cốc ựựng xylen.
Cốc 1: 3 giờ. Cốc 2: 3 giờ. Cốc 3: 3 giờ.
Sau khi xử lý lần lượt qua 3 cốc xylen miếng tổ chức trong như ựường phèn là ựược. Nếu không phải khử lại qua hệ thống cồn tuyệt ựối rồi ựưa vào dung dịch xylen làm trong.
+ Tẩm parafin: tổ chức sau khi ựược làm trong tiếp tục ựi qua hệ thống parafin gồm:
Cốc 1: parafin + xylen theo tỷ lệ 1:1 trong 4 giờ ở 370C. Cốc 2: parafin ở 560C trong 4 giờ. Cốc 3: parafin ở 560C trong 4 giờ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 + đúc Block: chuẩn bị ựầy ựủ dụng cụ, khuôn giấỵ Khi ựổ, parafin phải nóng chảy hoàn toàn và ựược lọc hết bọt khắ, nhiệt ựộ không ựược quá cao ựể không ảnh hưởng tới chất lượng tiêu bản. đợi cho parafin ựông ựặc hoàn toàn, bóc bỏ khuôn giấy và sửa lại block cho vuông vắn.
+ Cắt và dán mảnh: cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với ựộ dày 2 - 3ộm. Miếng tổ chức sau khi cắt ra sẽ ựược tãi phẳng trên phiến kắnh nhờ cho vào bình nước ấm. Chờ cho miếng tổ chức khô cho vào tủ ấm 370C trong 12 - 24 giờ.
+ Nhuộm tiêu bản theo các bước:
Tẩy parafin trong tiêu bản: lần lượt cho tiêu bản qua 3 cốc xylen, mỗi cốc từ 3-5 phút. Khi cho tiêu bản qua xylen phải thường xuyên nhấc lên nhấc xuống cho tan parafin, dùng khăn lau sạch parafin xung quanh tổ chức.
Tẩy xylen: cho tiêu bản sau khi tẩy qua 3 cốc cồn Etylic ựể tẩy xylen. Cốc 1: cồn 960 trong 3 - 5 phút.
Cốc 2: cồn 1000 trong 3 - 5 phút. Cốc 3: cồn 1000 trong 3 - 5 phút.
Rửa nước: cho tiêu bản vào khay rồi rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 5 - 10 phút. Dùng khăn mềm lau hết nước xung quanh tiêu bản.
Nhuộm Hematoxylin: ngâm tiêu bản trong dung dịch Hematoxylin trong 5- 10 phút tuỳ theo chất lượng của thuốc nhuộm và ựộ dày của tiêu bản. Sau khi nhuộm xong phải kiểm tra, nếu tiêu bản bắt màu nhạt có thể nhúng nhanh tiêu bản qua dung dịch NaHCO3 1% ựể tiêu bản ựậm màu hơn, nếu tiêu bản ựậm màu có thể nhúng nhanh qua cồn axitclohidric (1 phần HCl, 99 phần cồn Ethylic). Sau khi ựiều chỉnh màu, rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
Nhuộm Eosin: cho tiêu bản ựã nhuộm Hematoxylin vào dung dịch Eosin trong 5 - 10 phút tùy theo chất lượng thuốc nhuộm và ựộ dày tiêu bản. Nếu màu Eosin nhạt có thể cho vào dung dịch thuốc nhuộm Eosin 1 - 2 giọt axit axetic. Sau khi nhuộm rửa nhẹ tiêu bản bằng nước cất.
Tẩy nước: dùng cồn Ethylic tẩy nước trong tiêu bản bằng cách nhúng nhanh tiêu bản vào cốc cồn tuyệt ựối hoặc dùng cồn tuyệt ựối xịt lên tiêu bản.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 cho vào xylen trong tủ ấm 370C.
+ Gắn lamen, dán nhãn và ựọc kết quả trên kắnh hiển vi, chụp ảnh bệnh tắch vi thể.