- Diện tích lá: được xác định nhờ máy quét lá qua các giai đoạn sinh trưởng,
b. Xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp vi phân tích (theo mô tả trong tài liệu của tác giả Nguyễn Văn Mã, 2012) [19]
mô tả trong tài liệu của tác giả Nguyễn Văn Mã, 2012) [19]
Nguyên tắc:
Trong môi trường kiềm, đường khử kaliferixianua thành kaliferoxianua. Với sự có mặt của gelatin, kaliferoxianua kết hợp với sắt sunfat axit tạo thành phức chất xanh bền.
Hóa chất
- Dịch chiết từ mẫu hạt lạc: cân 1g mẫu, nghiền kĩ trong 10ml nước cất, li tâm 7.000 vòng/15 phút. Thu dịch trong phía trên để phân tích.
- Dung dịch kaliferixianua: hòa tan 1,65g K3Fe(CN)6 và 10g Na2CO3trong 1000ml nước cất. Bảo quản trong lọ thủy tinh màu nâu. - Dung dịch sắt sunfat axit: hòa tan 1g Fe2(SO4)3 trong 10ml H2SO4 đặc.
Đổ từ từ dung dịch vào nước cất có sẵn trong bình định mức, pha loãng đến mức 1000ml.
- Gelatin 10%: cân 10g gelatin với 100ml nước cất, để lên máy gia nhiệt ở nhiệt độ 500C để hòa tan gelatin.
- Dung dịch sắt sunfat axit gelatin: trộn lẫn dung dịch sắt sunfat axit với gelatin 10% theo tỉ lệ 20:1. Hỗn hợp chỉ sử dụng trong ngày.
Dụng cụ, thiết bị:
- Cối chày sứ, cốc thủy tinh, bình định mức, pipet… - Máy li tâm
Nguyễn Thanh Hiên: Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm-K14 ĐHSP Hà Nội 2 * Trang 31
- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-vis Shimadzu 2450 (Nhật Bản),…
Cách tiến hành:
- Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết đường và 2ml dung dịch kaliferixianua khuấy đều, đun sôi trong 15 phút, vừa đun vừa khuấy. - Sau đó để nguội, thêm vào ống 4ml dung dịch sắt sunfat axit gelatin,
khuấy đều, dẫn nước đến mức 30ml.
- Đo cường độ màu dung dịch trên máy UV-Vis 2450 Shimadzu (Nhật Bản) tại bước sóng 585nm.
- Hàm lượng đường khử trong dung dịch đường suy ra từ đường chuẩn glucoz.
Cách dựng đường chuẩn glucoz:
- Lấy 5 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1 đến 5, cho vào từng ống khối lượng đường tương ứng như sau: 20, 40, 60, 80, 100mg trong 2ml dung dịch.
- Sau đó tiến hành tương tự như ống thí nghiệm, so màu, xác định OD585nm. - Dựng đồ thị chuẩn - Kết quả đồ thị chuẩn: Bảng 2.1. Bảng nồng độ glucoz và giá trị OD585nm OD Nồng độ (µg/ml) 0,98 20 1,03 40 1,04 60 1,11 80 1,13 100
Nguyễn Thanh Hiên: Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm-K14 ĐHSP Hà Nội 2 * Trang 32
Hình 2.1 Biểu đồ biểu diễn đƣờng chuẩn đƣờng glucoz
- Phương trình đường chuẩn:
Y = 503,9.X - 473,2 (R2 = 0,957)
Trong đó: Y là nồng độ glucoz (mg/ml), X là giá trị OD tương ứng - Hàm lượng đường khử:
Y(mg/ml).V(ml) HLĐK=
W(g)
Trong đó: V là thể tích mẫu (30ml) W là số gam mẫu (1g)