Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại vẫn chưa được biết đầy đủ. Việc phân loại nấm Trichoderma vẫn còn đang tranh luận. Nhìn chung, phần lớn các tác giả thống nhất quan điểm nấm Trichoderma thuộc lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae, gồm 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Satunisporum, Pachybasium và Hypocreanum. Cho đến nay có hơn 50 loài Trichoderma khác nhau đã được tìm thấy [57].
Nấm Trichoderma có thể sơ bộ phân loại dựa vào một số chỉ tiêu như: hình dạng, màu sắc của bào tử, kích thước của bào tử, hình dạng cành bào tử, cách mọc của thể bình (phialide), sự phát triển của khuẩn lạc trên các loại môi trường ở các nhiệt độ khác nhau, mùi vị trên môi trường, sự phân bố của khuẩn lạc trên môi trường... Đặc điểm hình thái chung của nấm Trichoderma là sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều, cành bào tử không màu, bào tử rất nhiều, đính ở đỉnh của cành bào tử. Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Bào tử thường có màu xanh, đơn bào, hình trứng, tròn, elip, hoặc oval tùy theo từng loài. Cuống bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau, có kích thước từ 1 – 7µm, có hình đệm rất rắn chắc [57].
Trên cùng một môi trường nuôi cấy, mỗi loài Trichoderma có hình dạng khuẩn lạc khác nhau. Đây là một trong những đặc điểm để nhận dạng và phân biệt. Khuẩn lạc
Trichoderma phát triển rất nhanh và thành thục trong vòng 5 – 7 ngày. Trên môi trường PDA khi ủ ở nhiệt độ ở 250C, khuẩn lạc nấm Trichoderma lúc đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh vàng khi có bào tử xuất hiện. Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng (như T.
virens), vàng hay xanh xám. Ở một số loài Trichoderma còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch (môi trường PDA) có màu vàng. Một số loài Trichoderma còn tạo mùi đặc trưng như Trichoderma viride tạo mùi dừa [57].
Hầu hết các loài Trichoderma không có giai đoạn sinh sản hữu tính. Phương thức sinh sản vô tính được di truyền cho thế hệ sau bằng nhiều cách như: sự tiếp hợp, đột biến, hay sự sai biệt trong quá trình phân chia tế bào; nhờ đó nấm thích nghi và dần phát triển tạo nên một sự đa dạng, phong phú trong kiểu hình và kiểu gen của những dòng hoang dại. Đây là những dòng thích nghi tốt trong quá trình chọn lọc và cũng là những dòng có ý nghĩa trong việc sử dụng vào mục đích, kiểm soát mầm bệnh thực vật [14].
Trichoderma là một loại nấm đất, chúng phát triển tốt trên các loại đất giàu dinh dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật. Do đó Trichoderma có khả năng sử dụng nguồn hỗn hợp carbon và nitrogen. Nguồn carbon Trichoderma sử dụng được là đường đơn và đường đa, cùng với hỗn hợp polysaccharides, amino acid…[13].
Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2,5 – 9,5. Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 – 300C. Một vài dòng phát triển tốt ở 350C. Một số ít phát triển được ở 400C. Hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ nuôi cấy khác nhau. Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường, ở 370C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy [68].
1.4.2. Khả năng đối kháng với mầm bệnh của nấm Trichoderma
Ý niệm đầu tiên sử dụng nấm Trichoderma cho cây trồng có từ đầu thập kỷ 30. Weindling đã ghi nhận rằng bón nấm Trichoderma vào đất có thể bảo vệ được các cây con mới mọc từ hạt không bị bệnh [79]. Từ đó những nghiên cứu về nấm Trichoderma
đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới để ứng dụng phòng trừ bệnh hại cây trồng. Cho đến nay đã có khoảng 30 nước có những nghiên cứu sử dụng nấm
Trichoderma để trừ bệnh hại cây trồng như: Nga, Mỹ, Anh, Pháp, Đức, Hungari, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines, Malaysia... Thống kê cho thấy có khoảng 150 loài VSV (chủ yếu là nấm) gây bệnh trên 40 loài cây trồng đã được nghiên cứu phòng trừ bằng nấm Trichoderma.
Nấm Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống các bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra nhờ khả năng ký sinh. Theo Weindling thì đây là hiện tượng “giao thoa sợi nấm” [79]. Khi quan sát dưới kính hiển vi, hiện tượng ký sinh của
Trichoderma được mô tả như sau: Sợi nấm gây bệnh teo lại và chết tại những điểm nấm Trichoderma tiếp xúc với nấm gây bệnh. Bên cạnh đó, ở những điểm không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh thì nấm vẫn chết, các nhà nghiên cứu cho rằng điều này là do tác động của CKS từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh [13].
Vai trò lớn nhất của nấm Trichoderma là do nấm có khả năng sinh ra các enzyme và kháng sinh giúp chống lại các tác nhân gây bệnh ở thực vật. Tùy thuộc vào loài nấm
mà tạo ra các loại kháng sinh và enzyme khác nhau. Nấm Trichoderma có khả năng sinh ra các kháng sinh như: viridin, trichodermin, gliotoxin…hoặc các vitamin, carbonhydrate, nitrogen nhờ vậy làm đất tốt giúp cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt hơn. Sự kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma còn nhờ vào khả năng cạnh tranh không gian sống và nguồn dinh dưỡng với các tác nhân gây bệnh [58].
Nhiều nghiên cứu cho thấy Trichoderma có khả năng sản sinh các enzyme chitinase và β–glucanase với hàm lượng cao. Chitinase và β–glucanase giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh của loài nấm này với các loài nấm gây bệnh cho cây trồng. Nấm Trichoderma khi ký sinh trên nấm gây bệnh sẽ tiết ra 2 enzyme này để thủy phân vách tế bào của nấm gây bệnh [60], [63]. Bên cạnh sự tác động qua lại trong quần thể nấm đối kháng và nấm bệnh, nấm Trichoderma còn có tác động trực tiếp lên sự phát triển của cây trồng thông qua việc tiết ra các enzyme phân giải một số chất hữu cơ (cellulose, mùn, phosphate khó tan...) trong đất. Nhờ các enzyme này các chất hữu cơ có trong đất được phân hủy nhanh hơn, làm tăng chất dinh dưỡng dưới dạng dễ hấp thu cho cây trồng, tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt [13].
Tóm lại, Trichoderma được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học vì chúng có các hoạt động sau: a) xâm nhiễm lên đất hoặc một bộ phận của cây và chiếm một khoảng không gian vật lý ngăn cản sự nhân lên của tác nhân gây bệnh; b) sản xuất ra những enzyme phân hủy thành tế bào chống lại các tác nhân gây bệnh; c) sản xuất ra kháng sinh để tiêu diệt nguồn bệnh; d) kích kháng cơ chế miễn dịch của cây [58].
1.4.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng nấm Trichoderma trong bảo vệ thực vật
Hiện nay tại Mỹ, các chế phẩm PlantshieldTM và RootshieldTM từ loài
Trichoderma harzianum nòi T22 đã được khuyến cáo để sử dụng phòng trừ một số bệnh do nấm Botryris, Pythium, Rhizoctonia, Fusarium trên một số cây trồng. Chế phẩm được sử dụng bằng cách phun lên lá, tưới hay bón vào đất. Promote Plus cũng là một chế phẩm Trichoderma (T. koningii và T. harzianum) được khuyến cáo sử dụng tại đây để phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctonia solani, một số loài Pythium và
Scleotium rolfsii [13].
Theo Nguyễn Đăng Diệp và CS (2004), Trichoderma ức chế mạnh đối với các nấm gây bệnh cây trồng như: Fusarium solani, Scleotium rolfsii, Fusariumoxysporum. Đây là các loài nấm gây bệnh chết ẻo, bệnh thối nhũn cổ rễ, bệnh héo úa, đốm vàng lá cho nhiều loại cây trồng như lúa, ngô, rau, lạc, cao su, cà phê, chè, dâu tằm và một số cây ăn quả. [13].
Trần Thị Thu Hà và CS (2012) đã phân lập được 40 chủng nấm Trichoderma để khảo nghiệm khả năng ức chế và đối kháng với nấm bệnh Sclerotium rolfsii, trong đó có 11 chủng có hiệu quả ức chế cao; 26 chủng đối kháng trung bình và 3 chủng có khả năng ức chế yếu [8].
Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật, nấm Trichoderma chủ yếu được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong việc phòng trừ các bệnh do nấm gây ra. Ở nước ta, việc sử dụng nấm Trichoderma trong phòng trừ các bệnh thực vật do vi khuẩn nói chung và bệnh HXVK nói riêng đang còn rất hạn chế, hầu hết mới dừng lại ở mức độ nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và chưa có số liệu cụ thể nào cho thấy khả năng đối kháng của nấm
Trichoderma với bệnh HXVK. Chính vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng các tác nhân phòng trừ trong đó có nấm Trichoderma với bệnh HXVK hại ớt sẽ mở ra một hướng mới trong phòng trừ bệnh và tạo ra sản phẩm nông nghiệp an toàn.
1.5. TỔNG QUAN VỀ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES
1.5.1. Đặc điểm chung của xạ khuẩn và chi Streptomyces
Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, chia 5 phân lớp và 6 bộ, thuộc nhóm vi khuẩn thật, phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Trong đó, bộ được nhắc đến nhiều nhất (có giá trị trong y học và kinh tế) là bộ Actinomycetales. Bộ Actinomycetales có 13 dưới bộ, 42 họ và khoảng 200 chi trong đó có chi Streptomyces. Xạ khuẩn có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được [6]. Theo Waksman thì trong 1g đất có khoảng 29 nghìn đến 2,4 triệu mầm xạ khuẩn, chiếm 9 – 45% tổng số VSV [78].
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+), thường có tỉ lệ G–C trong DNA cao hơn 55%, đặc biệt giống Streptomyces có tỉ lệ này chiếm đến 69 – 78%. Về mặt hình thái chúng có cấu tạo dạng sợi phân nhánh. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng phóng xạ, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có nhiều màu sắc khác nhau như đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Hệ sợi cơ chất đâm sâu vào môi trường, hệ sợi khí sinh ngắn và phần lớn chúng có khả năng sinh bào tử. Trong môi trường lỏng, các sợi kết bện với nhau tạo thành khối cầu. Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 – 400A0 được chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH…[6].
Sự sinh trưởng, phát triển và khả năng tiết kháng sinh của xạ khuẩn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nguồn nitrogen, nguồn phosphate và các nguyên tố vi lượng. Trong đó, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) thường chỉ nằm trong khoảng 18 – 280C. pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzyme và tác động gián tiếp qua môi trường. Nguồn carbon thích hợp cho nhiều loài xạ khuẩn là tinh bột, một số chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucose, mannose, fructose, maltose...Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn carbon trong lên men sinh CKS [4], [6].
Chi Streptomyces là một chi xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm 1943. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện chi này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh. Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 – 10µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1 – 5mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi hệ sợi khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước [78].
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng...Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5µm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn...tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm
Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau [104].
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram (+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 300C, pH tối ưu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh). Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật. Cho đến nay, để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [6].
1.5.2. Khả năng đối kháng với mầm bệnh của xạ khuẩn
Một trong các đặc tính trợ sinh quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng sinh ra các CKS tiêu diệt mầm bệnh. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn.
Xạ khuẩn tiết ra các CKS như là một loại vũ khí sinh học diệt các sinh vật cạnh tranh với chúng trong môi trường. Kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng. Các phân tử kháng sinh ngăn cản sự hoạt động của enzyme gyrase trong quá trình sao chép của DNA. Do đó, các vi khuẩn không thể phân chia một cách bình thường. Còn bản thân xạ khuẩn thì có những cơ chế tự bảo vệ bằng hệ thống bơm phân tử (đẩy các phân tử kháng sinh ra ngoài), protein bảo vệ ribosome và các enzyme biến đổi, trung hòa các kháng sinh bằng cách sản xuất nhóm acetyl hay phosphate [3], [75].
Ngoài ra, xạ khuẩn còn có khả năng sản sinh nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase, cellulase, protease, chitinase và glucanase. Những enzyme này sẽ phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp trong đất (cellulose, mùn, chitin, lignin…), góp phần
quan trọng trong vòng tuần hoàn chuyển hóa các hợp chất và nâng cao độ tơi xốp, phì nhiêu cho đất. Chính điều này đã gián tiếp tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng, phát triển tốt, nâng cao sức đề kháng, hạn chế sâu bệnh [70]. Chitinase và β– 1,3–glucanase được coi là enzyme thủy phân quan trọng trong việc làm tan thành tế bào nấm bệnh, ví dụ như thành tế bào của Fusarium oxysporum, Sclerotinia rolfsii
[65], [74].
Streptomyces là một trong những nguồn hấp dẫn nhất tạo ra các chất có hoạt tính sinh học như vitamin, alkaloid, các yếu tố sinh trưởng thực vật, các enzyme và chất ức chế [70]. Streptomyces trong đất chính là yếu tố đóng góp vào đệm sinh học của đất và có vai trò trong sự phân hủy các chất hữu cơ nông nghiệp [56]. Nhiều nghiên cứu thậm chí cho thấy rằng việc sử dụng Streptomycetes còn tăng cường sự phát triển của cây trồng.
Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật, các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã nghiên cứu sử dụng các CKS từ xạ khuẩn trong việc ngăn chặn các bệnh thực vật. Tuy còn ở mức thấp nhưng đã thu được những thành tựu nhất định trong nền nông nghiệp hiện đại. Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây. Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây. Thông thường, một loài xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài loài VSV gây bệnh nhưng có những loài hoạt phổ rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây