Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, chia 5 phân lớp và 6 bộ, thuộc nhóm vi khuẩn thật, phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Trong đó, bộ được nhắc đến nhiều nhất (có giá trị trong y học và kinh tế) là bộ Actinomycetales. Bộ Actinomycetales có 13 dưới bộ, 42 họ và khoảng 200 chi trong đó có chi Streptomyces. Xạ khuẩn có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được [6]. Theo Waksman thì trong 1g đất có khoảng 29 nghìn đến 2,4 triệu mầm xạ khuẩn, chiếm 9 – 45% tổng số VSV [78].
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+), thường có tỉ lệ G–C trong DNA cao hơn 55%, đặc biệt giống Streptomyces có tỉ lệ này chiếm đến 69 – 78%. Về mặt hình thái chúng có cấu tạo dạng sợi phân nhánh. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng phóng xạ, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có nhiều màu sắc khác nhau như đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Hệ sợi cơ chất đâm sâu vào môi trường, hệ sợi khí sinh ngắn và phần lớn chúng có khả năng sinh bào tử. Trong môi trường lỏng, các sợi kết bện với nhau tạo thành khối cầu. Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 – 400A0 được chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH…[6].
Sự sinh trưởng, phát triển và khả năng tiết kháng sinh của xạ khuẩn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nguồn nitrogen, nguồn phosphate và các nguyên tố vi lượng. Trong đó, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) thường chỉ nằm trong khoảng 18 – 280C. pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzyme và tác động gián tiếp qua môi trường. Nguồn carbon thích hợp cho nhiều loài xạ khuẩn là tinh bột, một số chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucose, mannose, fructose, maltose...Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn carbon trong lên men sinh CKS [4], [6].
Chi Streptomyces là một chi xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm 1943. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện chi này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh. Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 – 10µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1 – 5mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi hệ sợi khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước [78].
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng...Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5µm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn...tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm
Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau [104].
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram (+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 300C, pH tối ưu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh). Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật. Cho đến nay, để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [6].
1.5.2. Khả năng đối kháng với mầm bệnh của xạ khuẩn
Một trong các đặc tính trợ sinh quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng sinh ra các CKS tiêu diệt mầm bệnh. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn.
Xạ khuẩn tiết ra các CKS như là một loại vũ khí sinh học diệt các sinh vật cạnh tranh với chúng trong môi trường. Kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng. Các phân tử kháng sinh ngăn cản sự hoạt động của enzyme gyrase trong quá trình sao chép của DNA. Do đó, các vi khuẩn không thể phân chia một cách bình thường. Còn bản thân xạ khuẩn thì có những cơ chế tự bảo vệ bằng hệ thống bơm phân tử (đẩy các phân tử kháng sinh ra ngoài), protein bảo vệ ribosome và các enzyme biến đổi, trung hòa các kháng sinh bằng cách sản xuất nhóm acetyl hay phosphate [3], [75].
Ngoài ra, xạ khuẩn còn có khả năng sản sinh nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase, cellulase, protease, chitinase và glucanase. Những enzyme này sẽ phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp trong đất (cellulose, mùn, chitin, lignin…), góp phần
quan trọng trong vòng tuần hoàn chuyển hóa các hợp chất và nâng cao độ tơi xốp, phì nhiêu cho đất. Chính điều này đã gián tiếp tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng, phát triển tốt, nâng cao sức đề kháng, hạn chế sâu bệnh [70]. Chitinase và β– 1,3–glucanase được coi là enzyme thủy phân quan trọng trong việc làm tan thành tế bào nấm bệnh, ví dụ như thành tế bào của Fusarium oxysporum, Sclerotinia rolfsii
[65], [74].
Streptomyces là một trong những nguồn hấp dẫn nhất tạo ra các chất có hoạt tính sinh học như vitamin, alkaloid, các yếu tố sinh trưởng thực vật, các enzyme và chất ức chế [70]. Streptomyces trong đất chính là yếu tố đóng góp vào đệm sinh học của đất và có vai trò trong sự phân hủy các chất hữu cơ nông nghiệp [56]. Nhiều nghiên cứu thậm chí cho thấy rằng việc sử dụng Streptomycetes còn tăng cường sự phát triển của cây trồng.
Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật, các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã nghiên cứu sử dụng các CKS từ xạ khuẩn trong việc ngăn chặn các bệnh thực vật. Tuy còn ở mức thấp nhưng đã thu được những thành tựu nhất định trong nền nông nghiệp hiện đại. Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây. Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây. Thông thường, một loài xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài loài VSV gây bệnh nhưng có những loài hoạt phổ rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất. Đây là quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên. Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh. Ngoài ra, nhiều xạ khuẩn còn tiết ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật cũng như kích thích các khu hệ VSV có lợi trong vùng rễ.
1.5.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng xạ khuẩn trong bảo vệ thực vật
Ngay từ những năm 1950, CKS có nguồn gốc từ xạ khuẩn đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. Việc sử dụng CKS trong bảo vệ thực vật ngày càng được áp dụng trên thế giới và đang dần thay thế cho việc sử dụng các loại chất hóa học độc hại. Một số loại kháng sinh chống bệnh ở thực vật như kasugamycin từ Streptomyces kasugaensis, blasticidin từ S. griseochromogenes, validamycin từ S. hygroscopicus... Các CKS này có độc tính thấp và có khả năng chống bệnh đạo ôn, khô vằn hại lúa.
Năm 2001, các nhà khoa học Ai Cập đã tuyển chọn được chủng Streptomyces plicatus có khả năng tổng hợp chitinase mạnh. Chitinase do S. plicatus có khả năng kháng các bệnh do nấm Fusarium oxysporum, Altrernaria alternata và Verticillium albo–atrum gây hại ở cà chua [43].
Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp.201 có khả năng sinh CKS mới là z–methylheptyl iso–nicotinate, CKS này có khả năng kháng được
nhiều loại nấm gây bệnh như: Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum, Fusarium moniliforme...[6].
Hiện nay, nước ta cũng đã bắt đầu sử dụng các CKS từ xạ khuẩn do Nhật Bản hay Trung Quốc sản xuất để thay thế dần cho việc sử dụng các chất hóa học độc hại trong công tác bảo vệ thực vật. Mặc khác, chúng ta cũng đã bắt đầu nghiên cứu, phân lập được một số chủng xạ khuẩn sinh CKS chống nấm bệnh như Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật.
Năm 2005, Đào Thị Lương và CS đã phân lập được từ đất chủng Streptomyces
sp. L30 có khả năng sinh CKS phổ rộng, kháng vi khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng R. solanacearum gây bệnh héo rũ ở cây trồng [14].
Năm 2008, Bùi Thị Hà đã nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn
Streptomyces phòng chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên. Tác giả đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn là R2, Đ1 có hoạt tính kháng nấm mạnh nhất và định danh chủng R2 là loài Streptomyces misawaensis; chủng Đ1 là loài Actinomyces brunneofungus [6].
Những kết quả nghiên cứu đạt được cho thấy xạ khuẩn hứa hẹn nhiều triển vọng, là đối tượng có tiềm năng cùng với các VSV truyền thống khác để sử dụng cho mục đích bảo vệ thực vật. Tuy nhiên việc sử dụng các CKS từ xạ khuẩn trong bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định.
1.6. PHÒNG TRỪ BỆNH HXVK BẰNG BIỆN PHÁP SINH HỌC1.6.1. Vài nét về phòng trừ sinh học bệnh cây 1.6.1. Vài nét về phòng trừ sinh học bệnh cây
1.6.1.1. Khái niệm phòng trừ sinh học bệnh cây
Theo Cook và Baker (1983), phòng trừ sinh học bệnh cây là thông qua việc sử dụng một hoặc nhiều sinh vật (ngoại trừ con người) để khống chế mầm bệnh hay làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một tác nhân gây hại nào đó [49]. Đến năm 1988, Cook đã đưa ra một khái niệm rộng hơn về phòng trừ sinh học. Theo ông phòng trừ sinh học bệnh cây là việc sử dụng sinh vật, gene và các sản phẩm của gene để điều khiển tác nhân gây bệnh. Các cách điều khiển tác nhân gây bệnh có thể là: (a) duy trì mật số nguồn bệnh ở mức thấp dưới ngưỡng kinh tế, (b) làm chậm hoặc loại trừ tiến trình xâm nhiễm của bệnh, (c) kích hoạt và tạo điều kiện phát huy hệ thống tự vệ của cây [50].
Theo Phạm Văn Kim, biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây là điều khiển môi trường, cây trồng và sinh vật đối kháng một cách thích hợp để tạo nên một thế cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại. Nhờ đó, bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng
quan trọng về mặt kinh tế. Biện pháp sinh học không có mục đích tiêu diệt toàn bộ mầm bệnh, và cũng không có khả năng này [11].
1.6.1.2. Vi sinh vật – một tác nhân phòng trừ sinh học
Nhiều công trình nghiên cứu về các tác nhân phòng trừ sinh học đã công bố từ đầu thế kỷ XX, trong đó có vi khuẩn. Nhóm vi khuẩn sử dụng trong phòng trừ sinh học phổ biến nhất là Pseudomonas spp., Bacillus spp. và Streptomyces spp. [49].
Qua những nghiên cứu về vi khuẩn ở vùng rễ, thân và lá cây, đã chia chúng thành ba loại: loại có hại cho cây, loại trung tính và loại có ích cho cây. Ảnh hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này là do chúng sản sinh ra chất kích thích sinh trưởng cây, các chất ức chế hoặc làm suy yếu tác nhân gây bệnh hoặc cả hai. Cơ chế ban đầu ức chế tác nhân gây bệnh là tiết ra các CKS. Tuy nhiên những yếu tố khác như việc tiết ra chất sidrophores, HCN, sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng có vai trò quan trọng trong việc ức chế tác nhân gây bệnh [49].
Một tác nhân phòng trừ sinh học quan trọng nữa là nấm Trichoderma. Cho đến nay Trichoderma spp. là một trong những tác nhân kiểm soát sinh học được nghiên cứu nhiều nhất và thương mại trên thị trường như là một thuốc trừ sâu sinh học mạnh, phân sinh học và cũng được sử dụng trong cải tạo đất. Tùy thuộc vào chủng
Trichoderma sử dụng trong nông nghiệp có thể cung cấp rất nhiều lợi thế: (a) chế độ kiểm soát vùng rễ cho phép thành lập nhanh chóng quần thể VSV có ích ổn định trong vùng rễ, (b) kiểm soát bệnh và cạnh tranh với VSV có hại sử dụng nhiều cơ chế khác nhau, (c) tăng khả năng kháng mầm bệnh của thực vật và (d) kích thích sự sinh trưởng và phát triển vật [57].
1.6.1.3. Một số nghiên cứu phòng trừ bệnh HXVK bằng biện pháp sinh học
Năm 2011, Akiko Fujiwara và CS (Đại học Kyoto) đã sử dụng các thể thực khuẩn để kiểm soát bệnh HXVK do R. solanacearum gây ra. Họ đã xử lý R. solanacearum với ba thể thực khuẩn: φRSA1, φRSB1, và φRSL1. Nhiễm φRSA1 và φRSB1 riêng lẽ hoặc kết hợp với các thể thực khuẩn khác, kết quả là sụt giảm nhanh chóng mật độ tế bào vi khuẩn trong cây ký chủ. Tất cả cây cà chua được xử lý bằng thể thực khuẩn φRSL1 đã không có triệu chứng héo trong thời gian thử nghiệm, trong khi tất cả các cây không được xử lý đã héo sau 18 ngày. φRSL1 tương đối ổn định trong đất, đặc biệt là ở nhiệt độ cao (37 – 500C). Dựa trên những quan sát thực nghiệm, họ đề xuất một phương pháp kiểm soát sinh học R. solanacearum bằng cách sử dụng thực khuẩn thể φRSL1 [44].
Năm 2011, các nhà khoa học ở Ai Cập cũng đã nghiên cứu, sử dụng 5 chủng vi khuẩn bao gồm: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis và
solanacearum hại cà chua trong điều kiện in vitro và in vivo. Kết quả trong điều kiện nhà kính, P. fluorescens cho tỷ lệ giảm bệnh cao nhất, tiếp theo P. putida và sau đó B. subtilis trong khi E. aerogenes cho thấy tỷ lệ giảm bệnh thấp nhất. Ngoài ra, cà chua khi được xử lý với tất cả các chủng vi khuẩn này thì nhận thấy có sự kích thích, sinh trưởng và phát triển nhanh trong điều kiện nhà kính [69].
Ở nước ta, Lê Lương Tề (2002) đã nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn cà chua có hiệu quả kinh tế cao bằng biện pháp sử dụng rộng rãi các giống cà chua kháng bệnh, có năng suất cao là CLN–1462A và P.T4719A ở vùng đồng bằng sông Hồng. Các giống này đã được đưa vào trồng đại trà ở các tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng và các tỉnh phía Bắc nước ta [18].
Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty và CS (2005) đã phân lập được chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. L30 có khả năng sinh CKS phổ rộng với các loại VSV kiểm định, đặc biệt là chống các chủng vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh với hoạt tính rất mạnh [14].
Tăng Thị Chính và Lý Kim Bảng (2005) đã tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn HD8, HD54, HD58 có khả năng ức chế vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh ở cây cà chua và cây dưa hấu [2].
Nguyễn Thị Hồng Hải và CS (2006) đã nghiên cứu đặc điểm sinh học và ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực vật trong phòng trừ bệnh héo xanh cây trồng. Từ 12 mẫu cây họ cà, hành, ớt thuộc các vùng sinh thái khác nhau đã phân lập được 16 chủng vi khuẩn nội sinh với các đặc điểm hình thái khác nhau. Tám trong số 16 chủng đó thể hiện hoạt tính đối kháng cao với vi khuẩn gây bệnh héo xanh R. solanacearum trong điều kiện in vitro [9].
Tác giả Nguyễn Thu Hà và CS (2006) trong quá trình nghiên cứu sử dụng