1.6.1. Vài nét về phòng trừ sinh học bệnh cây
1.6.1.1. Khái niệm phòng trừ sinh học bệnh cây
Theo Cook và Baker (1983), phòng trừ sinh học bệnh cây là thông qua việc sử dụng một hoặc nhiều sinh vật (ngoại trừ con người) để khống chế mầm bệnh hay làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một tác nhân gây hại nào đó [49]. Đến năm 1988, Cook đã đưa ra một khái niệm rộng hơn về phòng trừ sinh học. Theo ông phòng trừ sinh học bệnh cây là việc sử dụng sinh vật, gene và các sản phẩm của gene để điều khiển tác nhân gây bệnh. Các cách điều khiển tác nhân gây bệnh có thể là: (a) duy trì mật số nguồn bệnh ở mức thấp dưới ngưỡng kinh tế, (b) làm chậm hoặc loại trừ tiến trình xâm nhiễm của bệnh, (c) kích hoạt và tạo điều kiện phát huy hệ thống tự vệ của cây [50].
Theo Phạm Văn Kim, biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây là điều khiển môi trường, cây trồng và sinh vật đối kháng một cách thích hợp để tạo nên một thế cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại. Nhờ đó, bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng
quan trọng về mặt kinh tế. Biện pháp sinh học không có mục đích tiêu diệt toàn bộ mầm bệnh, và cũng không có khả năng này [11].
1.6.1.2. Vi sinh vật – một tác nhân phòng trừ sinh học
Nhiều công trình nghiên cứu về các tác nhân phòng trừ sinh học đã công bố từ đầu thế kỷ XX, trong đó có vi khuẩn. Nhóm vi khuẩn sử dụng trong phòng trừ sinh học phổ biến nhất là Pseudomonas spp., Bacillus spp. và Streptomyces spp. [49].
Qua những nghiên cứu về vi khuẩn ở vùng rễ, thân và lá cây, đã chia chúng thành ba loại: loại có hại cho cây, loại trung tính và loại có ích cho cây. Ảnh hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này là do chúng sản sinh ra chất kích thích sinh trưởng cây, các chất ức chế hoặc làm suy yếu tác nhân gây bệnh hoặc cả hai. Cơ chế ban đầu ức chế tác nhân gây bệnh là tiết ra các CKS. Tuy nhiên những yếu tố khác như việc tiết ra chất sidrophores, HCN, sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng có vai trò quan trọng trong việc ức chế tác nhân gây bệnh [49].
Một tác nhân phòng trừ sinh học quan trọng nữa là nấm Trichoderma. Cho đến nay Trichoderma spp. là một trong những tác nhân kiểm soát sinh học được nghiên cứu nhiều nhất và thương mại trên thị trường như là một thuốc trừ sâu sinh học mạnh, phân sinh học và cũng được sử dụng trong cải tạo đất. Tùy thuộc vào chủng
Trichoderma sử dụng trong nông nghiệp có thể cung cấp rất nhiều lợi thế: (a) chế độ kiểm soát vùng rễ cho phép thành lập nhanh chóng quần thể VSV có ích ổn định trong vùng rễ, (b) kiểm soát bệnh và cạnh tranh với VSV có hại sử dụng nhiều cơ chế khác nhau, (c) tăng khả năng kháng mầm bệnh của thực vật và (d) kích thích sự sinh trưởng và phát triển vật [57].
1.6.1.3. Một số nghiên cứu phòng trừ bệnh HXVK bằng biện pháp sinh học
Năm 2011, Akiko Fujiwara và CS (Đại học Kyoto) đã sử dụng các thể thực khuẩn để kiểm soát bệnh HXVK do R. solanacearum gây ra. Họ đã xử lý R. solanacearum với ba thể thực khuẩn: φRSA1, φRSB1, và φRSL1. Nhiễm φRSA1 và φRSB1 riêng lẽ hoặc kết hợp với các thể thực khuẩn khác, kết quả là sụt giảm nhanh chóng mật độ tế bào vi khuẩn trong cây ký chủ. Tất cả cây cà chua được xử lý bằng thể thực khuẩn φRSL1 đã không có triệu chứng héo trong thời gian thử nghiệm, trong khi tất cả các cây không được xử lý đã héo sau 18 ngày. φRSL1 tương đối ổn định trong đất, đặc biệt là ở nhiệt độ cao (37 – 500C). Dựa trên những quan sát thực nghiệm, họ đề xuất một phương pháp kiểm soát sinh học R. solanacearum bằng cách sử dụng thực khuẩn thể φRSL1 [44].
Năm 2011, các nhà khoa học ở Ai Cập cũng đã nghiên cứu, sử dụng 5 chủng vi khuẩn bao gồm: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis và
solanacearum hại cà chua trong điều kiện in vitro và in vivo. Kết quả trong điều kiện nhà kính, P. fluorescens cho tỷ lệ giảm bệnh cao nhất, tiếp theo P. putida và sau đó B. subtilis trong khi E. aerogenes cho thấy tỷ lệ giảm bệnh thấp nhất. Ngoài ra, cà chua khi được xử lý với tất cả các chủng vi khuẩn này thì nhận thấy có sự kích thích, sinh trưởng và phát triển nhanh trong điều kiện nhà kính [69].
Ở nước ta, Lê Lương Tề (2002) đã nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn cà chua có hiệu quả kinh tế cao bằng biện pháp sử dụng rộng rãi các giống cà chua kháng bệnh, có năng suất cao là CLN–1462A và P.T4719A ở vùng đồng bằng sông Hồng. Các giống này đã được đưa vào trồng đại trà ở các tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng và các tỉnh phía Bắc nước ta [18].
Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty và CS (2005) đã phân lập được chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. L30 có khả năng sinh CKS phổ rộng với các loại VSV kiểm định, đặc biệt là chống các chủng vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh với hoạt tính rất mạnh [14].
Tăng Thị Chính và Lý Kim Bảng (2005) đã tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn HD8, HD54, HD58 có khả năng ức chế vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh ở cây cà chua và cây dưa hấu [2].
Nguyễn Thị Hồng Hải và CS (2006) đã nghiên cứu đặc điểm sinh học và ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực vật trong phòng trừ bệnh héo xanh cây trồng. Từ 12 mẫu cây họ cà, hành, ớt thuộc các vùng sinh thái khác nhau đã phân lập được 16 chủng vi khuẩn nội sinh với các đặc điểm hình thái khác nhau. Tám trong số 16 chủng đó thể hiện hoạt tính đối kháng cao với vi khuẩn gây bệnh héo xanh R. solanacearum trong điều kiện in vitro [9].
Tác giả Nguyễn Thu Hà và CS (2006) trong quá trình nghiên cứu sử dụng
Bacillus nhằm nâng cao năng suất và hạn chế bệnh HXVK đối với cây lạc cho thấy: từ 20 chủng nghiên cứu đã lựa chọn được 3 chủng Bacillus là B.14, B.16 và B.18 đa hoạt tính sinh học. Đường kính vòng vô khuẩn ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh của các chủng B.14, B.16, B.18 là: 10, 30 và 20mm. Ba chủng Bacillus lựa chọn có khả năng kiểm soát bệnh HXVK trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo (đất vô trùng). Nhiễm
Bacillus hoặc hỗn hợp Bacillus và Rhizobium làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh HXVK của cây lạc khác nhau, tùy thuộc vào giống và mùa vụ [7].
Lê Như Kiểu và CS (2010) cũng đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm VSV phòng chống bệnh HXVK hại cây lạc quy mô phòng thí nghiệm. Các tác giả đã sử dụng chủng giống cho lạc gồm Ps1 (Pseudomonas fluorescens), TS6 (Pseudomonas sp.), BK1 (Bacillus sp.), Ba5.1 (Bacillus subtilis) và T15 (Bacillus megaterium). Kết quả cho thấy, hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh của các công thức xử lý chế phẩm VSV1 và L1 so với đối chứng là 44,41% và 33,33% [12].
Các nghiên cứu trên cho thấy rằng việc sử dụng các chủng VSV trong phòng trừ bệnh HXVK hiện rất có triển vọng ứng dụng, đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.
1.7. PHÒNG TRỪ BỆNH THÁN THƯ BẰNG BIỆN PHÁP SINH HỌC
Đây là biện pháp sử dụng các hợp chất kháng nấm có nguồn gốc tự nhiên (chitosan và các dẫn xuất của nó,...), hoặc các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm. Chitosan và các dẫn xuất như oligochitosan là các hợp chất phân hủy sinh học. Chitosan và oligochitosan là các polycation có khả năng kết hợp mạnh mẽ với các bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharid (alginate), axit béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (NH2) do đó nó có khả năng kháng nấm [101].
Hiện nay các biện pháp phòng trừ sinh học đang được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước.
Tổng hợp các kết quả trên cho thấy tiềm năng của việc sử dụng các tác nhân phòng trừ bệnh thán thư trên cây ớt
Chương 2
MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
2.1.1. Mục tiêu chung
Phòng trừ hiệu quả bệnh héo xanh vi khuẩn (R. solanacearum) và bệnh thán thư (C. Capsici) hại ớt để phát triển sản xuất ớt bền vững và ổn định.
2.1.2. Mục tiêu cụ thể
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nấm Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces đến sinh trưởng phát triển và năng suất ớt.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nấm Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces đến phòng trừ bệnh thán thư và héo xanh vi khuẩn hại ớt.
2.2. PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU2.2.1. Phạm vi nghiên cứu 2.2.1. Phạm vi nghiên cứu
* Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại:
- Phòng thí nghiệm bệnh cây, bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông học, Trường Đại Học Nông Lâm Huế - Đại học Huế.
- Bố trí thí nghiệm tại xã Gio Thành huyện Gio Linh tỉnh Quảng Trị.
* Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện vụ đông xuân 2013-2014.
2.2.2. Đối tượng nghiên cứu
- Cây ớt: giống ớt sừng trâu địa phương: Trái hơi cong ở đầu, dài 10 - 15 cm, cho năng suất 8 - 10 tấn/ha, dễ bị bệnh thán thư và xoăn đọt do vi rút.
- Đất bố trí thí nghiệm là đất cát trồng ớt một vụ.
- Chế phẩm từ nấm đối kháng Trichoderma do PGS- TS Trần Thị Thu Hà cung cấp.
- Chế phẩm từ xạ khuẩn đối kháng Streptomyces do PGS- TS Trần Thị Thu Hà cung cấp.
- Bệnh thán thư (Collectotrichum sp.) và bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralsonia solanacearum) hại ớt.
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces đến sinh trưởng phát triển ớt và một số vi sinh vật đất trước và sau thí nghiệm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nấm Trichoderma và xạ khuẩn Streptomyces trong phòng trừ bệnh thán thư (Collectotrichum sp.) và bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralsonia Solanacearum) hại ớt.
- Đánh giá hiệu quả kinh tế
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Đánh giá hiệu quả phòng trừ của các chế phẩm từ nấm Trichoderma và xạ
khuẩn Streptomyces ngoài đồng ruộng
2.4.1.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Dựa vào nội dung thí nghiệm để bố trí thí nghiệm ở điều kiện tự nhiên ngoài đồng ruộng với các công thức thí nghiệm đơn lẻ và kết hợp tại tại xã Gio Thành huyện Gio Linh tỉnh Quảng Trị vụ Đông Xuân 2013-2014.
- Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB) với 3 lần nhắc lại trên các chân đất nhiễm bệnh thán thư và héo xanh vi khuẩn nặng.
TT Công thức thí nghiệm
Đối chứng Đối chứng – Không xử lý
T100 Xử lý chế phẩm Trichoderma tỷ lệ 100% S100 Xử lý chế phẩm Streptomyces tỷ lệ 100%
TS50:50 Xử lý kết hợptỷ lệ 50% Trichoderma + 50% Streptomyces
TS70:30 Xử lý kết hợp tỉ lệ 70% Trichoderma + 30% Streptomyces
TS30:70 Xữ lý kết hợptỉ lệ 30% Trichoderma + 70% Streptomyces
- Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Diện tích ô thí nghiệm là 14m2 kể cả rãnh luống (10m x 1,4m). Khoảng cách giữa các lần nhắc là 20cm. Xung quanh khu thí nghiệm có 1 luống bảo vệ trồng ớt.
Khoảng cách giữa 2 hàng 70cm, cây cách cây 40cm. Số cây mỗi ô thí nghiệm 50 cây, mật độ khoảng 35000 cây/ha.
Sơ đồ thí nghiệm
Lượng phân bón cho 1 ha: Phân chuồng 15 tấn; 110 kg N, 80 kg P2O5 , 140kg K2O, bón thêm 600kg vôi bột khi làm đất.
- Phương pháp xử lý chế phẩm:
Chế phẩm được xử lý 2 lần:
Lần thứ nhất xử lý chế phẩm khi đưa cây ra trồng ngoài đồng ruộng; nhúng rễ cây ớt vào chế phẩm và đem trồng, với liều lượng là 0,5kg cho 1 sào.
Lần thứ 2 xử lý chế phẩm khi ớt bắt đầu ra hoa; hòa 1kg chế phẩm với 200 lít nước, tưới mỗi gốc ớt 0,5 lít nước chế phẩm đã hòa chế phẩm.
2.4.2. Phương pháp phân tích VSV đất trước và sau bố trí thí nghiệm* Chọn mẫu đất * Chọn mẫu đất
Loại bỏ lớp đất dày 2 – 3 cm trên cùng.
Mỗi công thức lấy mẫu đất theo 5 điểm chéo góc, mỗi mẫu 1 nắm, sau đó trộn đều trong 1 túi nilon.
Số mẫu đất: 6 mẫu lấy vào ngày 14/05/2014 tại các công thức xữ lý chế phẩm khác nhau và được ký hiệu như sau: Đối chứng; T100; S100; TS50:50; TS70:30; TS30:70.
Mô tả đặc điểm đất: - Đối chứng: Không xữ lý chế phẩm. - T100: Xứ lý chế phẩm Trichoderma tỷ lệ 100% - S100: Xữ lý chế phẩm Streptomyces tỷ lệ 100% - TS50:50 Xử lý kết hợptỷ lệ50% Trichoderma + 50% Streptomyces Bảo vệ Bảo vệ Đối chứng a TS50:50 a S100 a TS30:70 a T100 a TS70:30 a Bảo vệ TS30:70 b S100 b TS70:30 b T100 b TS50:50 b Đối chứng b TS50:50 c T100 c TS30:70 c Đối chứng c TS70:30 c S100 c Bảo vệ
- TS70:30: Xử lý kết hợptỷ lệ70% Trichoderma + 30% Streptomyces
- TS30:70: Xử lý kết hợptỷ lệ30% Trichoderma + 70% Streptomyces
* Bảo quản mẫu
Mẫu đất lấy về phải phân tích ngay trong vòng 24 giờ, nếu không thì phải cất mẫu trong tủ lạnh với nhiệt độ 4 – 5oC khoảng một tuần.
* Chuẩn bị mẫu
Cân 1g đất cho vào 1 chén sứ đã khử trùng.
Lấy 2 bình tam giác dung tích 250ml, một bình có sẵn 100ml nước cất vô trùng, bình kia để không.
Lấy 1ml nước từ bình thứ nhất cho vào chén sứ chứa 1g đất ở trên để làm nhão đất, rồi nghiền nát bằng chày cao su vô trùng.
Lấy nước vô trùng ở bình thứ nhất để chuyển hỗn hợp đất đã nghiền nát vào bình không, sau đó lắc dung dịch đất 5 phút. Để yên 30 phút, dung dịch đất này có độ pha loãng 100 (1:102) lần.
Lấy 6 ống nghiệm đã vô trùng, mỗi ống chứa 4ml nước cất vô trùng. Sau đó lấy dung dịch đất có độ pha loãng 100 lần ở trên cho vào ống nghiệm thứ nhất thì ta được dung dịch có độ pha loãng 1000 lần (1:103), sau đó lại lấy 1ml từ ống nghiệm này chuyển sang ống nghiệm thứ 2 ta được độ pha loãng 1:104, và cứ tiếp tục cho đến độ pha loãng 1:107.
* Pha môi trường
Môi trường phân lập vi khuẩn tổng số (MPA)
Cao thịt: 1g Peptone: 10g Agar: 20g Nước: 1 lít
Khử trùng 1210C trong 15 phút
Môi trường phân lập nấm sợi (Zapek – dok)
Saccharoze: 30g NaNO3: 3g KH2PO4: 1g MgSO4: 0,5g
KCl: 0,5g FeSO4: vết Agar: 20g
Môi trường phân lập xạ khuẩn (Gause)
Glucose: 20g K2HPO4: 0,5g MgSO4: 0,5g NaCl: 0,5g KNO3: 1g FeSO4: vết Agar: 20g
Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải xenlulose (Vinogratxki)
KNO3: 12,5 g NaCl: 2,5g FeSO4: 0,05 g MgSO4.7H2O: 2,5g KH2PO4: 5g Mn2(SO4)3: 0,05 g Nước: 1 lít Agar: 20g
Môi trường phân giải Photphat khó tan
Nước: 1 lít Glucose: 10g MgCl2.6H2O: 5g Ca3(PO4)2: 5g MgSO4: 0,25g KCl: 0,2g (NH4)2SO4: 0,1 g
Môi trường phân lập vi sinh vật sinh màng nhầy polyssaccaride (Ashby)
CaSO4.2H2O: 0,1g K2HPO4: 0,2g MgSO4.7H2O: 0,2 g NaCl: 0,2 g CaCO3: 5 g Nước: 1 lít Agar: 20 g
* Phương pháp cấy trên môi trường đặc Chuẩn bị môi trường thạch đĩa
Pha các loại môi trường thích hợp với từng loại vi sinh vật, hấp ở 1210C trong 20 phút. Để nguội đến 40 – 450C thì đổ vào hộp petri đã vô trùng, mỗi hộp khoảng 20 – 30 ml.
Cấy và dàn đều dịch pha loãng
Dùng pipet vô trùng cấy từ các độ pha loãng khác nhau vào các hộp petri, mỗi hộp cấy 0,1ml.
Dùng que gạt thủy tinh vô trùng dàn đều thể tích này lên khắp bề mặt môi trường. Cấy ở 2 độ pha loãng: 1:104 và 1:106
Mỗi độ pha loãng cấy lặp lại 3 lần
Nuôi cấy và đếm số khuẩn lạc
Cấy xong nuôi cấy ở nhiệt độ 280C trong 2 – ̀5 ngày Sau đó, đếm số khuẩn lạc trong từng hộp petri.
2.4.3. Diễn biến khí hậu thời tiết trong thời gian thí nghiệm
Quảng Trị nằm ở phía nam của Bắc Trung Bộ, trọn vẹn trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa, là vùng chuyển tiếp giữa hai 2 miền khí hậu. Miền khí hậu phía bắc có mùa đông lạnh và phía nam nóng ẩm quanh năm. ở vùng này khí hậu khắc nghiệt, chịu