3. đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2Phương pháp gây nhiễm virus trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp
Dùng trứng gà có phôi ựã ấp ựược 9 ngày (Giống Leghorn) tiến hành theo các bước sau:
+ Soi ựể chọn những quả có phôi sống khoẻ.
+ Giết lạnh phôi ựồng thời làm co mạch máu, tiêu ựộc trứng, gắp phôi ra ựĩa Petri.
+ Rửa bằng dung dịch PBS- 3 lần.
+ Cắt nhỏ phôi và rửa phôi trên máy khuấy từ 2 lần
+ Rửa tiếp bằng dung dịch Trypsin 0,125%.
+ Hút bỏ phần nước trong ở trên.
+ Tiêu hoá tế bào bằng dung dịch Trypsin 0,25% trên máy khuấy từ trong phòng ấm 370C .
+ Lọc tế bào qua lưới lọc và ly tâm lạnh với tốc ựộ 2000 vòng/phút .
+ Chắt bỏ nước trong, dùng môi trường phát triển ựể pha loãng tế bào.
+ đếm tế bào trên buồng ựếm hồng cầu, ựịnh lượng tế bào .
+ Pha tế bào thành nồng ựộ 0,5% (tương ựương 75x104 tế bào /ml), chia tế bào ra các chai nuôi và ựặt trong phòng ấm 370C.
+ Hàng ngày quan sát khả năng phát triển của tế bào xơ phôi gà trong các chai tế bào trên kắnh hiển vi quang học.
3.4.2 Phương pháp gây nhiễm virus trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp một lớp
- Sản xuất tế bào xơ phôi gà một lớp.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
mặt chai nuôi thì ựược gây nhiễm virus.
- Dùng môi trường Eagle MEM pha loãng giống virus, sau ựó gây nhiễm vào các chai ựã có tế bào phát triển tốt. Nuôi cấy tiếp ở 370C.
+ Hàng ngày quan sát bằng kắnh hiển vi ựể phát hiện bệnh tắch tế bào (CPE). Sau khi gây nhiễm virus nhân lên và gây bệnh lý tế bào trên 80% thì tiến hành thu hoạch huyễn dịch (bán thành phẩm).
+ Lấy mẫu bán thành phẩm kiểm tra vô trùng, chuẩn ựộ hiệu giá virus. Trong thời gian kiểm tra phải bảo quản huyễn dịch ựó trong tủ lạnh âm 450C.