- Pha vacxin
d/ Hoàn thiện sản phẩm
Lô vacxin sau khi có kết quả kiểm nghiệm ựạt tiêu chuẩn, ựược dán nhãn, ựóng hộp và nhập kho thành phẩm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 50
4.2.2. Xác ựịnh liều gây nhiễm thắch hợp của virus ựậu gà chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào môi trường nuôi cấy tế bào
để xác ựịnh liều gây nhiễm tối ưu của virus giống trên môi trường nuôi cấy tế bào, chúng tôi tiến hành pha loãng giống thành các nồng ựộ 10-3, 10-4 và 10-5 tương ựương với 104, 103 và 102 TCID50/ml (hiệu giá virus giống là 107,7TCID50/ ml) sau ựó gây nhiễm vào các chai tế bào ựã phát triển ựẹp.Hàng ngày kiểm tra bệnh tắch tế bào. Những chai có bệnh tắch hoàn toàn (CPE 100%) ựược lấy mẫu và chuẩn ựộ hiệu giá virus. Trong thắ nghiệm này chúng tôi bố trắ thành 3 lô (tương ứng với 3 liều gây nhiễm), tiến hành trong cùng ựiều kiện ựể so sánh và ựánh giá sự phá hủy tế bào. Ở lô ựối chứng sử dụng 5 chai không gây nhiễm virus.
Kết quả ựược trình bày trên bảng 4.6.
Bảng 4.6: Kết quả xác ựịnh liều gây nhiễm thắch hợp của virus ựậu gà
nhược ựộc chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào
Lô TN
Nội dung Lô I Lô II Lô III Lô Đ/c
Số chai TN 5 5 5 5
Nồng độ pha
loãng virus 10
-5 10-4 10-3 0
Liều gây nhiễm 102 TCID50 103 TCID50 104 TCID50 0 Thời gian bắt đầu
có CPE (giờ) 48 48 24 Thời gian có CPE 100% (giờ) 120 72 72 Tế bào vẫn nguyên vẹn, không có CPE Hiệu giá virus
(TCID50/0,1ml) 6,4 6,7 6,6 0
Qua bảng 4.6 cho thấy: ở các nồng ựộ pha loãng virus khác nhau tương ựương với các liều gây nhiễm khác nhau thì thời gian xuất hiện bệnh tắch tế bào và bị phá hủy hoàn toàn (CPE 100%) cũng khác nhau.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 51
Ở nồng ựộ pha loãng virus 10-5 (tương ựương với liều gây nhiễm 102TCID50) thì sau 48 giờ bắt ựầu xuất hiện bệnh tắch tế bào và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 120 giờ gây nhiễm virus. Sau 120 giờ gây nhiễm, môi trường dinh dưỡng ựã bị chuyển màu do nuôi thời gian dài.
Với nồng ựộ pha loãng virus 10-4 (tương ựương với liều gây nhiễm 103TCID50) cũng thì sau 48 giờ bắt ựầu xuất hiện bệnh tắch tế bào nhưng thời gian tế bào bị phá hủy hoàn toàn ựã rút ngắn xuống 72 giờ. Ở thời ựiểm này bệnh tắch tế bào rõ rệt, môi trường nuôi cấy còn chất dinh dưỡng, chưa chuyển màu.
Nồng ựộ pha loãng virus 10-3 (tương ựương với liều gây nhiễm 104TCID50) bệnh tắch tế bào xuất hiện sớm nhất là 24 giờ sau khi gây nhiễm virus và ựến 72 giờ tế bào bị phá hủy hoàn toàn.
Huyễn dịch virus thu ựược ở các nồng ựộ pha loãng sau khi gây nhiễm virus (thu hoạch ở thời ựiểm có CPE 100%) ựược chuẩn ựộ xác ựịnh hiệu giá virus. Hiệu giá virus thu ựược cho thấy ở nồng ựộ pha loãng 10-4 cho hiệu giá virus cao nhất (106,7TCID50/ 0,1 ml) và thấp nhất ở nồng ựộ pha loãng 10-5 (hiệu giá ựạt 106,4TCID50/ 0,1 ml).
điều này có thể lý giải như sau: ở nồng ựộ pha loãng virus càng thấp thì lượng virus càng nhiều, do vậy virus sinh trưởng và phát triển nhanh chóng và gây bệnh tắch tế bào. Khi lượng virus trong tế bào nhân lên tới ựỉnh cao nó sẽ phá hủy các tế bào ựể xâm nhập sang các tế bào khác. Nhưng khi lượng virus quá nhiều mà lượng tế bào nuôi lại hết thì virus sẽ bị chết.
Ở lô ựối chứng: các chai ựối chứng không gây nhiễm virus, theo dõi ựến 120 giờ, tế bào vẫn nguyên vẹn, nhưng ựã có tế bào già bong ra khỏi thành chai nuôi. Tuy nhiên, tế bào vẫn phủ kắn diện tắch mặt nuôi.
Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi rút ra kết luận: Liều gây nhiễm virus ựậu gà chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà thắch hợp nhất là 103 TCID50/ ml (tương ựương với nồng ựộ pha loãng virus giống gốc là 10-4).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 52 Log10TCID50/ 0.1ml 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7
Liều gây nhiễm (TCID50)
Hình 4.5: Hiệu giá virus ựậu gà của các liều gây nhiễm
4.2.3. Xác ựịnh thời ựiểm thắch hợp ựể thu hoạch huyễn dịch sau khi gây nhiễm virus ựậu gà chủng C nhiễm virus ựậu gà chủng C
Việc xác ựịnh thời ựiểm thắch hợp ựể thu hoạch huyễn dịch virus sau khi gây nhiễm ựể có ựược hàm lượng virus trong huyễn dịch là cao nhất, là yêu cầu cần thiết trong sản xuất vacxin.
Với 3 lô thắ nghiệm, mỗi lô gây nhiễm 10 chai tế bào nuôi cấy sau 48 giờ ựạt tiêu chuẩn với liều gây nhiễm là 103 TCID50/ ml. Sau khi gây nhiễm, hàng ngày quan sát bệnh tắch tế bào bằng kắnh hiển vi quang học. Tại các thời ựiểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi gây nhiễm, ựều lấy một chai thu hoạch ựể chuẩn ựộ hiệu giá virus.
Kết quả ựược trình bày trên bảng 4.7.
Từ kết quả bảng 4.7 cho thấy: với cùng một liều gây nhiễm (103TCID50/ ml), ở thời ựiểm 24 giờ sau gây nhiễm hiệu giá virus rất thấp, biến ựộng từ 102,9 TCID50/ 0,1 ml ựến 103,5 TCID50/ 0,1 ml (hiệu giá virus trung bình là 103,2 TCID50/ 0,1 ml).
Ở thời ựiểm 48 Ờ 72 giờ sau khi gây nhiễm, hiệu giá virus là tương ựương nhau, biến ựộng từ 106,3 Ờ 106,9 TCID50/ 0,1 ml tương ựương với hiệu giá virus
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 53
giống gốc. Cũng tại thời ựiểm này, các chai tế bào ựều có CPE từ 80 Ờ 100%.
Bảng 4.7: Kết quả xác ựịnh thời ựiểm thắch hợp ựể thu hoạch
huyễn dịch virus
Hiệu giá virus (TCID50/ 0,1 ml) Lô TN Số lượng chai tế bào Liều gây nhiễm 24h 48h 72h I 10 103TCID50 103,1 106,3 106,7 II 10 103TCID50 103,5 106,5 106,6 III 10 103TCID50 102,9 106,4 106,9
Hiệu giá virus trung bình
(TCID50/ 0,1 ml) 103,2 106,4 106,7
để minh hoạ những kết quả ựược rõ, chúng tôi ựã biểu diễn hiệu giá virus của huyễn dịch thu ựược ở các thời ựiểm sau khi gây nhiễm virus trên môi trường nuôi cấy tế bào trên hình 4.6.
0 2 4 6 8