Kết quả Lô TN Số gà kiểm tra/ lần TN (con) Liều tiêm (liều) đường dùng vacxin Thời gian theo dõi Sống Chết Tỷ lệ an toàn (%) 1 10 10 10/10 0/10 100 2 10 10 10/10 0/10 100 3 10 10 Chủng dưới da 14 ngày 10/10 0/10 100 Theo kết quả kiểm tra trên bảng 4.4 cho thấy: Sau khi chủng dưới da virus giống gốc ựậu gà chủng C nuôi cấy trên môi trường tế bào và theo dõi trong 14 ngày, tất cả số gà ựược chủng ựều sống khoẻ, phát triển bình thường, không có phản ứng cục bộ cũng như phản ứng toàn thân.
Như vậy, lô giống gốc ựậu gà trên môi trường nuôi cấy tế bào ựạt kết quả kiểm tra an toàn với tỷ lệ 100%.
4.1.3.3. Kiểm tra tắnh sinh miễn dịch của virus giống.
Chủng C nuôi cấy trên môi trường tế bào
Ống giống gốc ựược hoàn nguyên bằng dung dịch PBS- vô trùng, sau ựó pha loãng thành nồng ựộ 10-4 (tương ựương với 1 liều virus giống gốc).
Lô thắ nghiệm: sử dụng 10 gà (2-6 tuần tuổi), chủng dưới da cho 10 gà với 1 liều virus giống gốc.
Lô ựối chứng: dùng 10 gà không chủng virus giống.
Virus ựậu gà cường ựộc ựược chuẩn ựộ và xác ựịnh liều gây nhiễm là 102LD50.
Theo dõi gà sau 14 ngày chủng virus giống. Hàng ngày quan sát các triệu chứng của gà. 14 ngày sau khi chủng, tất cả gà (miễn dịch và ựối chứng) ựược thử thách với virus cường ựộc với liều 102LD50 theo ựường chủng dưới da.
Tiếp tục theo dõi trong 14 ngày. Hiệu lực của giống gốc ựược ựánh giá thông qua số gà thắ nghiệm ựược bảo hộ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47
Kết quả ựược trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra tắnh sinh miễn dịch của lô giống gốc ựậu gà
nhược ựộc chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào
Qua bảng 4.5 cho thấy: Ở cả 3 lô thắ nghiệm, với những gà ựược tiêm chủng virus giống gốc ựậu gà chủng C thắch nghi trên môi trường tế bào xơ phôi gà, qua thời gian theo dõi 14 ngày, tất cả gà ựều sống khỏe mạnh, ăn uống và hoạt ựộng bình thường. Sau 14 ngày, tất cả số gà ựược chủng virus giống gốc ựều bảo hộ với virus ựậu gà cường ựộc, gà không có biểu hiện triệu chứng, bệnh tắch của bệnh ựậu gà. Tỷ lệ bảo hộ ựạt 100%. Trong khi ựó, ở lô ựối chứng: gà không ựược chủng virus giống gốc, theo dõi 4 Ờ 7 ngày sau khi chủng, toàn bộ gà ựều có triệu chứng và bệnh tắch ựiển hình của bệnh ựậu gà.
Qua các thắ nghiệm trên, chúng tôi rút ra kết luận:
- Virus ựậu gà chủng C thắch ứng và ổn ựịnh trên môi trường tế bào xơ phôi gà sau 6 lần cấy chuyển.
- Hiệu giá của virus giống ựược giữ làm giống gốc là 107,7TCID50/ml. - Giống gốc virus ựậu gà chủng C nuôi cấy trên môi trường tế bào vô trùng, an toàn và ựạt hiệu lực. Kết quả Lô TN Số gà/ lần TN (con) Liều chủng (liều) Liều cường ựộc (LD50) Số gà sống/ số gà CCđ Số gà chết/ số gà CCđ Tỷ lệ bảo hộ (%) 1 10 1 102 10/10 0/10 100 2 10 1 102 10/10 0/10 100 3 10 1 102 10/10 0/10 100 đ/c 10 0 102 0/10 10/10 0
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 48
4.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN
4.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin ựậu gà nhược ựộc ựông khô nuôi cấy trên môi trường tế bào. ựông khô nuôi cấy trên môi trường tế bào.
Quy trình sản xuất vacxin đậu gà ựược thực hiện theo sơ ựồ sau:
Hình 4.4: Sơ ựồ quy trình sản xuất vacxin nhược ựông khô đậu gà bằng
công nghệ nuôi cấy tế bào
Quy trình sản xuất vacxin đậu gà nhược ựộc ựông khô là một quy trình khép kắn, toàn bộ quá trình ựược kiểm soát nghiêm ngặt, ựặc biệt là chỉ tiêu vô trùng. Vì vậy, các nguyên liệu ựưa vào ựể phục vụ sản xuất vacxin phải ựược lựa chọn kỹ, ựúng tiêu chuẩn, ựồng thời tỷ lệ của các chất ựưa vào vacxin cũng phải thắch hợp. Trên cơ sở ựó, chất lượng vacxin mới ựảm bảo.
a/ Nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp.
Nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp: Trứng gà có phôi ựược ấp 10 ổ 1 ngày tuổi ựược thu hoạch phôi. Sử dụng panh, kéo vô trùng cắt bỏ ựầu phôi, chân, cánh, loại bỏ hết nội tạng, rửa sạch bằng dung dịch PBS-. Cắt nhỏ phôi và tiêu hoá bằng dung dịch Trypsin 0,25%. Sau khi tiêu hoá tế bào ựược ly
Nuôi cấy tế bào xơ phôi gà
ộ ớ
Bổ xung chất bổ trợ Thu hoạch huyễn dịch virus
Chia liều, ựông khô
Bảo quản, dán nhãn, nhập
Nuôi cấy 370C
Gây nhiễm virus Kiểm tra vô trùng
Kiểm tra vô trùng Chuẩn ựộ hiệu giá virus
Kiểm tra vô trùng Kiểm tra an toàn Kiểm tra hiệu lực
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 49
tâm và thu hoạch lấy tế bào. Pha loãng huyễn dịch tế bào thu ựược theo nồng ựộ 0,5% vào môi trường Eagle có bổ sung 1% huyết thanh dê, 1% kháng sinh gốc, 1% NaHCO3, chia ra các chai nuôi và nuôi cấy ở nhiệt ựộ 37oC. Hàng ngày kiểm tra sự phát triển của tế bào bằng kắnh hiển vi.
b/ Gây nhiễm virus ựậu gà
Giống virus ựậu gà chủng C ựược pha loãng vào môi trường nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vào tế bào xơ phôi gà 1 lớp ựã nuôi cấy 48 giờ. Sau khi gây nhiễm virus, hàng ngày kiểm tra bệnh tắch tế bào (CPE) bằng kắnh hiển vi ựiện tử. Sau gây nhiễm virus 48 - 72 giờ, những chai nuôi cấy có bệnh tắch tế bào (CPE) ≥ 80% ựược thu hoạch và tập trung lại vào bình lớn.
Huyễn dịch virus sau khi thu hoạch ựược kiểm tra vô trùng và chuẩn ựộ hiệu giá virus. Trong thời gian kiểm tra phải bảo quản huyễn dịch ựó trong tủ lạnh âm 450C.
c/ Pha ựông khô vacxin - Chất bổ trợ. - Chất bổ trợ.
- Sữa tách bơ (Skim milk): 15 gam - Nước cất hai lần vừa ựủ: 100 ml - Hoà tan, hấp 1150C/ 35 Ờ 40 phút.
