PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.3.1Thí nghiệm 8: Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng các chủng vi khuẩn tương tác đến sự nảy mầm của giống lúa trong điều kiện in vitro
đến sự nảy mầm của giống lúa trong điều kiện in vitro
Các hạt giống lúa được khử trùng theo Sheng Qin và cs (2009) sau đĩ với từng giống lúa chọn lựa các hạt cĩ cùng kích thước bố trí thí nghiệm với mỗi cơng thức là 15 hạt. Thí nghiệm trong điều kiện in vitro được thực hiện trong các bình trụ cĩ chứa mơi trường nền là: nước + 7% thạch nhằm duy trì độ ẩm cho nảy mầm của hạt. Các số liệu được thu thập và theo dõi sau 10 đến 15 ngày.
Các hạt lúa sau khi được khử trùng được ngâm trong dung dịch vi khuẩn cĩ nồng độ tương ứng 108 cfu/ml trong 45 phút ở 28 ± 2oC. Thí nghiệm được xây dựng dựa trên các nghiên cứu trước đĩ của (Sariah và cs, 2012), (Gholami và cs, 2009)
CT0
Đối chứng (khơng lây nhiễm
vi khuẩn)
0 cfu/ ml OD600 = 0,0
CT2 Chủng B 108 cfu/ ml OD600 = 0,1 CT3 Chủng C 108 cfu/ ml OD600 = 0,1 CT4 Chủng D 108 cfu/ ml OD600 = 0,1 CT5 Chủng A + B 108 cfu/ ml OD600 = 0,1 CT6 Chủng A + C 108 cfu/ ml OD600 = 0,1 CT7 Chủng A + D 108 cfu/ ml OD600 = 0,1 CT8 Chủng B + C 108 cfu/ ml OD600 = 0,1 CT9 Chủng B + D 108 cfu/ ml OD600 = 0,1 CT10 Chủng C + D 108 cfu/ ml OD600 = 0,1
5. Phương pháp nghiên cứu 5.1 Phương pháp phân lập
Sử dụng phương pháp phân lập của Gina Holguin và cs (1993) để phân lạp các vi khuẩn vùng rễ và các vi khuẩn cộng sinh bên trong rễ
• Phân lập các vi khuẩn vùng rễ
Mười gram đất vùng rễ được đưa vào bình tam giác 250 ml, và thêm 90 ml nước cất vơ trùng vào nĩ.
Giai đoạn cơng phá mẫu bằng máy lắc trong 10 phút.
Một ml huyền phù đã được thêm vào ống nghiệm 9 ml và lắc trong 2 phút. Kỹ thuật pha lỗng nối tiếp được thực hiện tối đa 107 lần.
Một lượng huyền phù thứ tự 100 đến 200 µL này đã được cấy trải trên mơi trường LB đặc.
Được nuơi cấy trong 3 ngày ở 28 ° C để quan sát các khuẩn lạc của vi khuẩn.
Các vi khuẩn được chọn lọc thơng qua hình thái bề mặt, màu sắc sao cho phù hợp với chủng loại và mục đích nghiên cứu.
- Các khuẩn lạc được chọn lọc bị lẫn tạp tiếp tục được pha lỗng và xây dựng dãy nồng độ tương tự như trên và cấy lên đĩa thạch để giảm mật độ vi khuẩn để thu được vi khuẩn mong muốn một cách thuần nhất khơng lẫn tạp. Sau đĩ lại cấy lên mơi trường LB và nuơi ở 28oC trong 3 ngày.
- Các khuẩn lạc khơng bị lẫn tạp hoặc đã được làm thuần ở trên thì được cấy vạch để thu sinh khối sử dụng cho thí nghiệm xây dựng khả năng tổng hợp IAA
• Phân lập các vi khuẩn cộng sinh trong rễ:
1. Rễ được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong ethanol 95% và HgCl2 0,1% trong 1 phút
2. Tương ứng và sau đĩ rửa sạch (tối thiểu 10 lần) với nước cất vơ trùng.
3. Thay thế và tiếp tục khử trùng bằng cách ngâm rễ trong ethanol 70% trong 5 phút, trong sodium hypochlorite 5,5% trong 10 phút
4. Tiếp theo là nước rửa lặp lại nhiều lần bằng nước vơ trùng hoặc ngâm trong H2O2 10% trong 15 giây và sau đĩ súc rửa 3 lần với MgSO4 0.1M
5. Nguyên liệu rễ được cố định trong 0,05 M PBS hoặc MgSO4 0.1 M và được nghiền bằng cối và chày. Huyền phù cĩ thể được lọc qua bơng gịn vơ trùng. Phần lọc được được pha lỗng hoặc khơng pha lỗng sau đĩ được chuẩn bị sẵn sàng cho cấy vào mơi trường làm giàu.
6. Một phương pháp phân lập thay thế là rễ khử trùng được lây lan trong điều kiện vơ trùng trên mơi trường thạch dinh dưỡng bổ sung glycerol 1% để xác nhận tính vơ trùng của bề mặt rễ. Rễ được cắt theo chiều dọc, đặt vào mơi trường làm giàu đã chọn LB. Phân lập phải được lặp lại nhiều lần cùng một mơi trường vững chắc cho đến khi độ tinh khiết thu được.
Tương tự như thí nghiệm 1 thì sau khi chúng ta làm thuần được vi khuẩn chúng ta cấy chúng trên mơi trường LB đặc để thu sinh khối lớn nhất sử dụng trong thí nghiệm xây dựng khả năng tổng hợp IAA.
Hình 4: Phân lập vi khuẩn tổng hợp IAA cộng sinh trong rễ lúa