Dựa theo phương pháp của: Folin, O., and Ciocalteu, V., (1929) [58]. * Nguyên lý: Dựa trên sự bắt màu xanh tớm đặc trưng của amino acid khi có mặt của thuốc thử Folin-Ciocalteu,s Phenol, hấp thụ tốt nhất ở bước sóng 660nm.
* Tiến hành thí nghiệm: + Chuẩn bị hoá chất:
1. Đệm Phosphate 50mM, pH=7.5
2. Dung dịch casein 0,65% trong 50mM đệm Phosphate: Cân 0,65g casein vào 100ml dung dịch đệm trên, đun nóng nhẹ đến 80-900C trong 10 phút và khuấy cho tan (chỉnh pH 7,5 bằng NaOH 1M và HCl 1M).
3. Axit tricloacetic 110mM. Pha dung dịch TCA 6,1N (9,967g TCA/10ml nước cất siêu sạch), lấy 9ml TCA 6,1N pha với nước siêu sạch thành 500ml. 4. Dung dịch thuốc thử Folin và Ciocateu,s phenol. Pha loãng Folin và Ciocateu,s phenol với nước cất siêu sạch theo tỉ lệ 1:3.
5. Na2CO3 500mM : Cân 53g Na2CO3 trong 1000ml nước siêu sạch
6. Đệm acetat natri 10mM, acetat canxi 5mM: Cân 0,82g acetat natri +0,79 acetat canxi trong 1000ml nước siêu sạch (chỉnh pH 7,5 bằng NaOH 0,1M, CH3COOH 0,1M).
7. L-Tyrosine 1μmol/ml: cõn 1,81mg tyrosine pha trong 10ml nước siêu sạch, dùng máy khuấy từ khuấy đều cho tan.
+ Dựng đường chuẩn L-Tyrosine: Pha dung dịch gốc 1μmol/ml L-Tyrosine trong đệm 50mM Phosphate. Từ đó pha loóng thành các nồng độ 0.01; 0.02; 0.04; 0.06; 0.08; 0.1; 0.12; 0.14; 0.16; 0.18; 0.2 (μmol/ml). Lấy 400μl Tyrosine + 1000μl Na2CO3 + 200μl Folin. Ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đo ở bước sóng λ660nm.
Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ L-Tyrosine và giá trị OD được xõy dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-3)
Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa OD660 và hàm lượng Tyrosine y = 0.3536x - 0.0018 R2 = 0.9971 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.2 0.4 0.6 A 660 H àm l ư ợ ng Ty ros ine (m ic rom ol ) Hàm lượng Tyrosine Linear (Hàm lượng Tyrosine)
Hình 2-3. Đường chuẩn thể hiện mối tương giữa OD660 và hàm lượng Tyrosine
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng L-Tyrosine và giá trị OD660nm thu được là y=0.3536-0.0018. Trong đó: y là hàm lượng L-
Tyrosine trong 1ml dịch; x là giá trị OD660nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,9971 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
* Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của Protease:
+ Thí nghiệm: 250μl dung dịch 0,65% casein + 50μl dịch enzyme đã pha loãng phù hợp. Ủ ở 500
C trong 30 phút, bổ sung 250àl dung dịch TCA để dừng phản ứng.
+ Đối chứng: 250μl dung dịch 0,65% casein + 250àl dung dịch TCA +50μl dịch enzyme đã pha loãng phù hợp. Ủ ở 500C trong 30 phút.
Li tâm mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng 10000 v/phỳt trong 5 phút. Lấy 400μl dịch li tâm + 1ml Na2CO3 500mM + 200μl Folin. Ủ 5-10phút, đo OD660. Từ giá trị OD ta tính được lượng enzyme (IU/ml) được tạo ra nhờ phương trình y=0.3536-0.0018 (trong đó: y là hàm lượng L-Tyrosine trong
1ml dịch; x là giá trị OD660nm tương ứng).
Qui ước: : Một đơn vị hoạt tính protease (IU) là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 àmol acid amin (tớnh theo L-Tyrosine) trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.