Dựa theo phương pháp của Miller G.L. (1959) [49].
* Nguyên lý: CMC-ase phõn cắt cacboxymethylcellulase (CMC) và amylase phõn cắt tinh bột thành các oligosaccharide và glucose có tớnh khử có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng.
* Tiến hành thí nghiệm:
+Pha dung dịch cơ chất: dung dịch 0,5% CMC hoặc dung dịch 1% tinh bột ngô trong đệm 50mM Na-acetat, pH 5,5.
+ Dung dịch thuốc thử DNS: Hoà tan 2g phenol và 10g NaOH trong 300ml nước cất, sau đó thêm tiếp 0,5g Na2SO3, 200g KNaC4H4O6.4H2O, 10g DNS, khuấy đều cho cỏc hoỏ chất tan hoàn toàn. Bổ sung thêm nước cất để đạt 1000 ml.
+ Dựng đường chuẩn D-glucose: Pha dung dịch gốc 10μmol/ml D-glucose trong đệm 50mM Na-acetat. Từ đó pha loóng thành các nồng độ 0; 2; 4; 6; 10 (μmol/ml). Lấy 50μl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên + 450μl dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750μl dịch thuốc thử DNS. Đun cách thuỷ trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ540nm.
Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xõy dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-1)
y = 15.759x + 0.5181 R2 = 0.9912 0 2 4 6 8 10 12 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 A540nm N ồ n g đ ộ D -g lu co se ( m ic ro m o l/m l) Series1 Linear (Series1) Hình 2-1. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng D-glucose bằng DNS
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-glucose và giá trị OD540nm thu được là y=15,759x + 0,15181. Trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong 1ml dịch; x là giá trị OD540nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,9912 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
+ Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của CMC-ase và amylase:
- Thí nghiệm: 450μl dung dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 50μl dịch enzyme đã pha loóng thích hợp. Ủ ở 50oC trong 30 phút, sau đó bổ sung 750μl dung dịch DNS để dừng phản ứng
- Đối chứng: 450μl dung dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750μl dung dịch DNS + 50μl dịch enzyme đã pha loóng thích hợp. Ủ ở 50oC trong 30 phút.
Đun cách thuỷ mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5-7 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540nm. Từ giá trị OD ta tớnh được lượng đường khử được tạo ra nhờ đường chuẩn theo phương trình
y=15,759x + 0,15181 (trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong 1ml dịch; x
là giá trị OD540nm tương ứng).
Quy ước: Một đơn vị hoạt tớnh (IU) của CMC-ase (hoặc amylase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μmol đường khử trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm dùng glucose là đường chuẩn.