1.5.1. Làm sạch phlorotannin bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng
1.5.1.1. Nguyên lý
- Nguyên tắc: Nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn được vào nhau (trong hai dung môi này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong một dụng cụ chiết, như phễu chiết, bình chiết. Hệ số phân bố nhiệt động của cân bằng chiết là một yếu tố quyết định hiệu quả của sự chiết và tiếp đến là sự ảnh hưởng của nhiệt độ, môi trường acid. Chiết theo kiểu này có hai cách là chiết tĩnh và chiết theo dòng chảy liên tục. Trong phân tích, kiểu tĩnh được ứng dụng nhiều hơn bởi sự đơn giản của nó.
- Điều kiện chiết: Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm bảo được các yêu cầu nhất định sau đây:
* Dung môi chiết phải tinh khiết cao, để không làm nhiễm bẩn thêm các chất phân tích vào mẫu.
* Dung môi chiết phải hoà tan tốt các chất phân tích, nhưng lại không hoà tan tốt với các chất khác có trong mẫu.
* Hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho việc chiết được triệt để. * Cân bằng chiết nhanh đạt được và thuận nghịch.
* Sự phân lớp khi chiết phải rõ ràng, nhanh và dễ tách ra riêng biệt các pha. * Phải chọn môi trường acid, pH, loại acid thích hợp,
* Phải thực hiện trong nhiệt độ phù hợp và giữ không đổi trong cả quá trình. * Phải lắc hay trộn đều mạnh để quá trình chiết xẩy ra được tốt.
Quá trình chiết lỏng - lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỉ số nồng độ trong hai pha là một hằng số.
[A]hc KA=
[A]n
KA : hằng số phân bố
[Ahc]: nồng độ của chất A trong pha hữu cơ. [An]: nồng độ của chất A trong pha nước.
1.5.1.2. Phương pháp tiến hành
Sau khi thu được dịch chiết phlorotannin thô có chứa các chất hữu cơ như màu, acid béo, các chất hữu cơ đi kèm dạng phân cực và không phân cực. Để loại chất đi kèm trong quá trình chiết phlorotannin, tiến hành phương pháp chiết lỏng-lỏng . Đây là phương pháp làm sạch chất thông dụng, dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao.
Sử dụng các chất chiết theo mức độ tăng dần độ phân cực của chúng như: hexan, chloroform, ethylaxetat, butanol.
Lựa chọn hệ chiết lỏng-lỏng:
Phlorotannin hòa tan trong nước sau đó khảo sát các hệ chiết Phlorotannin(nước)/ hexan – Xác định hệ số phân bố
Phlorotannin(nước)/ dicloetan - Xác định hệ số phân bố Phlorotannin (nước)/ ethyl axetat - Xác định hệ số phân bố Phlorotannin(nước)/ butanol - Xác định hệ số phân bố Từ đó tìm hệ chiết thu được phlorotannin độ sạch kỹ thuật.
1.5.2. Tinh chế phlorotannin bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp phụ là silicagel
1.5.2.1. Nguyên lý
Sắc kí (Chromatography) là phương pháp tách, phân ly, phân tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …). Trong hệ thống sắc kí chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc kí. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách và làm sạch các chất qua quá trình sắc kí.
Trong các phương pháp phân tách hiện nay, sắc kí là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất ra khỏi một hỗn hợp, ngay cả những hỗn hợp phức tạp về thành phần và khác nhau về hàm lượng trọng hỗn hợp như dịch chiết từ các hợp chất từ cây cỏ. Từ khi phương pháp sắc kí ra đời (1903) cho tới nay rất nhiều kỹ thuật sắc kí cũng như các cải tiến về pha tĩnh, thiết bị và phương pháp phát hiện đã được phát triển và áp
dụng trong thực tế để phân tích định tính, định lượng và chiết tách các chất, đặc biệt là thành phần hóa học của cây cỏ.
Nguyên lí tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc kí khác: một mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxid).Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung môi giải hấp và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau tạo các dải riêng biệt có vị trí khác nhau ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau, làm cơ sở cho việc phân tích định tính và định lượng.
1.5.2.2. Phương pháp tiến hành
Sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng thu được phlorotannin kỹ thuật, tiếp tục làm sạch chúng bằng phương pháp sắc kí cột sử dụng 01 chất hấp thụ là silicagel.
* Tinh chế phlorotannin bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp phụ là silicagel: Lựa chọn dung môi rửa giải thích hợp.
* Tinh chế phlorotannin bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp phụ là silicagel lần 2: Lựa chọn dung môi rửa giải thích hợp và kiểm tra sự có mặt của phlorotannin bằng sắc kí bản mỏng.
1.5.3. Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm tinh bằng phương pháp sắc kí bản mỏng và HPLC-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) mỏng và HPLC-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Sau khi thu được phlorotannin tinh chế, chế phẩm này sẽ phải được kiểm tra độ tinh sạch để có thể định hướng sử dụng. Phương pháp được áp dụng để kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm tinh là phương pháp sắc kí bản mỏng và HPLC-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
1.6. Tổng quan về quá trình tách chiết - Rong nguyên liệu - Rong nguyên liệu
Rong khô thu mua đã được xử lý và có nguồn gốc rõ ràng. Mẫu rong đã thu thập được rửa sạch các chất bẩn cơ học và phơi khô trong bóng râm.
Mục tiêu lựa chọn rong khô: Hàm lượng ẩm trong rong nhỏ góp phần ức chế sự phát triển của vi sinh vật sống trên rong, ức chế quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa trong rong, từ đó rong được bảo quản tốt hơn, đảm bảo cho quá trình thực hiện không gặp gián đoạn về vấn đề nguyên liệu. Đồng thời khi hàm lượng ẩm nhỏ, tốc độ trích ly
tăng lên (do độ ẩm tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán).
- Rửa sạch:
Rong được rửa sạch nhằm loại bỏ tạp chất và muối bám dính trên rong, tạo điều kiện cho quá trình chiết và lọc được dễ dàng.
- Cắt nhỏ:
Sau khi rửa sạch, rong được làm ráo sơ bộ, rồi cắt hoặc băm nhỏ với kích thước thuận lợi cho quá trình chiết rút, mục đích là làm tăng diện tích tiếp xúc của rong nguyên liệu và dung môi, đồng thời phá vỡ cấu trúc tế bào rong, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi. Tuy nhiên, không nên xay hoặc nghiền rong quá nhỏ, bởi kích thước bột rong quá nhỏ sẽ làm cản trở quá trình lọc.
- Chiết rút:
Phlorotannin là hợp chất hữu cơ có khả năng tan trong một số dung môi phân cực và không phân cực. Các yếu tố dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết đều có ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của phlorotannin trong quá trình chiết. Vì vậy, tại công đoạn chiết, ta sẽ tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng chiết của phlorotannin.
+ Xác định ảnh hưởng của các dung môi khác nhau đến khả năng chiết phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa
Dung môi khảo sát: nước, methanol 50 %, ethanol 50 %, hexane, dichlomethane, buthanol, acetone, ethylaxetat. Tìm ra dung môi thích hợp. Lựa chọn dung môi theo 02 tiêu chí: Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa.
+ Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi
Khảo sát các tỉ lệ sau: 1:5, 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30; 1:35; 1:40; 1:45; 1:50 để xác định khả năng chiết rút của rong nguyên liệu vơí các lượng dung môi khác nhau, từ đó tìm ra tỉ lệ thích hợp nhất theo các tiêu chí: hoạt tính chống oxi hóa, khối lượng chất chiết, hàm lượng phlorotannin.
+ Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết.
Xác định nhiệt độ chiết hợp lý bằng cách khảo sát khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết ở các nhiệt độ khác nhau: 400C, 500C, 600C, 700C, 800C, 900C,
1000C, tìm ra nhiệt độ chiết thích hợp theo các tiêu chí: hoạt tính chống oxi hóa, khối lượng chất chiết, hàm lượng phlorotannin.
+ Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết.
Khảo sát các khoảng thời gian: 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 phút. Tìm ra thời gian chiết thích hợp theo 02 tiêu chí: hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa.
- Lọc:
Sau khi chiết rút, tiến hành lọc thu hồi các chất hòa tan được trong dung môi, loại bỏ tạp chất không tan (cặn, bã rong).
- Chiết lỏng – lỏng:
Sau khi lọc sẽ thu được dịch chiết phlorotannin thô có chứa các chất hữu cơ như màu, acid béo, chất hữu cơ đi kèm phân cực và không phân cực. Chiết lỏng – lỏng sẽ giúp loại bỏ các chất đi kèm này, tạo điều kiện tốt hơn khi tiếp tục làm sạch bằng sắc kí cột.
- Làm sạch bằng sắc kí cột:
Mục đích của đề tài là thu phlorotannin theo định hướng sử dụng làm dược liệu, do đó đòi hỏi chế phẩm phải có độ tinh sạch nhất định. Phương pháp làm sạch bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp phụ là silicagel là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất ra khỏi hỗn hợp, thu lấy chế phẩm tinh theo yêu cầu.
CHƯƠNG II:
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Hình 2.1. Rong mơ Sargassum mcclurei
Loài rong mơ Sarrgassum mcclurei ở Việt Nam, chủ yếu ở vùng biển Nam Trung
bộ. Rong khi thu nhận đã được rửa qua nước biển và phơi khô trong bóng râm đến độ ẩm bảo quản.
Chủng loại sinh vật : Rong biển Ngành: Heterokontophyta
Lớp: Phaeophyceae
Bộ: Fucales
Họ: Sargassaceae
Chi: Sarrgassum
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Quy trình dự kiến để nghiên cứu tách chiết phlorotannin
Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu
- Kiểm tra sản phẩm bằng HPLC-MS - Thử nghiệm hoạt tính Làm tinh sạch bằng sắc kí cột Chế phẩm Phlorotannin Sấy phun Đánh giá sản phẩm Dịch chiết kỹ thuật Phlorotannin tinh Thử nghiệm hoạt tính Dịch chiết thô Chiết lỏng – lỏng Chọn dung môi thích hợp Rong nguyên liệu (khô)
Băm nhỏ
Chiết rút Rửa sạch
2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Các phương pháp phân tích hóa học và vật lý * Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldadl (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng lipid tổng bằng phương pháp Bligh và Dyer hỗn hợp chloroform/methanol. (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng iod theo phương pháp chuẩn độ (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng tro toàn phần bằng phương pháp trọng lượng (Phụ lục 1) * Xác định hàm lượng xơ thô theo Crudefibre và định lượng carbohydrate (Phụ lục 1) * Xác định hàm lượng alginate bằng phương pháp khối lượng (Phụ lục 1)
* Xác định fucoidan bằng phương pháp A.I.Usov (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết bằng phương pháp Mayalen Zubia [18]
Hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết được xác định bằng phương pháp so màu, dung thuốc thử Folin - Ciocalteu ở bước sóng 750 nm.
a. Nguyên lý
Oxi hóa toàn bộ lượng phlorotannin trong dịch chiết bằng dung dịch Folin - Ciocalteu ( hỗn hợp acid photphotungstic và acid phosphomolyblic). Các acid này sẽ bị khử thành vonfram (W8O23) và oxit molipden (Mo8O23) có màu xanh. Màu xanh được hấp thụ nhiều nhất ở bước sóng 750 nm.
b. Dụng cụ, hóa chất Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất:
- Dung dịch phloroglucin 0.1% làm chuẩn.
- Dung dịch thuốc thử Folin - Ciocalteu ( sản phẩm thương mại) - Na2CO3 10%
c. Tiến hành
- Chuẩn bị mẫu: Cân 0,05 g mẫu đã được đông khô, nghiền nhỏ rồi pha loãng 10 lần với nước cất. Lắc mạnh để hòa tan các chất trong dung dịch (dung dịch mẫu 1).
(dd mẫu 2)
- Chuẩn bị mẫu thử vào ống nghệm sạch:
Om: 1ml dd mẫu 2 + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 Pha loãng 10 lần dung dịch chuẩn C6H6O3 0,1% (dd chuẩn 1).
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Lấy 5 ống thủy tinh sạch sau đó cho vào môi ống: C1: 0 ml dd chuẩn 1 + 1ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C2: 0.2 ml dd chuẩn 1 + 0.8ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C3: 0.4 ml dd chuẩn 1 + 0.6ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C4: 0.6 ml dd chuẩn 1 + 0.4ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C5: 1ml dd chuẩn 1 + 0ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3
- Sau khi đã chuẩn bị mẫu và chuẩn, đặt các ống nghiệm này trong bóng tối khoảng 60 - 90 phút.
- Sau khoảng thời gian trên quan sát ta thấy màu xanh đen xuất hiện và tiến hành so màu bằng máy quang phổ UV - Vis ở bước sóng 750 nm, ghi độ hấp thụ và tính toán xác định được lượng phlorotannin có trong mẫu thử.
2.2.2.2. Phương pháp cảm quan
Tiến hành đánh giá cảm quan dịch chiết theo phương pháp mô tả.
2.2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính
* Xác định hoạt tính chống oxi hóa tổng số
a. Nguyên lý
Hoạt tính oxi hóa tổng số được xác định theo phương pháp Prieto et al. (1999) [25]. b. Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất:
- Dung dịch thuốc thử (0,6 M sulfuric acid, 28 mM sodium phosphate và amoni 4mM molybdat)
c. Tiến hành
(0,6 M sulfuric acid, 28 mM sodium phosphate và amoni 4mM molybdat) được ủ ở 95°C trong 90 phút. Sau khi hỗn hợp đã được làm lạnh tới nhiệt độ phòng, độ hấp thụ được đo ở 695 nm bằng máy quang phổ UV - Vis.
Tất cả các kết quả đã được tính toán xác định thể hiện như acid ascorbic mg tương đương cho mỗi gram rong biển khô.
* Xác địnhhoạt tính khử sắt theo phương pháp Zhu, Chang, and Hsu (2000)[32]
a. Nguyên tắc
Hoạt tính khử sắt được xác định theo phương pháp của Zhu (2002) [12] . b. Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất:
- Dung dịch đệm phosphat (pH = 7,2)
- Dung dịch potassium ferricyanide 1% (w / v) - Dung dịch acid tricloaxetic (10%)
- Dung dịch sắt clorua c. Tiến hành
0,2 ml dịch chiết polyphenol đã được thêm vào 1.0 ml đệm phosphat (pH = 7,2) và 1,0 ml potassium ferricyanide 1% (w / v) và 0,8 ml nước cất. Các hỗn hợp phản ứng sau đó đã được ủ ở 50°C trong 20 phút. Sau đó, 1,0 ml acid tricloaxetic (10%) đã được thêm vào hỗn hợp trên. Hỗn hợp này được trộn với nước cất (0,6ml) và 0,16ml sắt clorua. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo tại 655nm của quang phổ UV-Vis (ELISA Reader, Bio-Rad, Mỹ).
Tất cả các kết quả được tính toán xác định thể hiện bằng mg Fe2 + tương đương