- Rong nguyên liệu
Rong khô thu mua đã được xử lý và có nguồn gốc rõ ràng. Mẫu rong đã thu thập được rửa sạch các chất bẩn cơ học và phơi khô trong bóng râm.
Mục tiêu lựa chọn rong khô: Hàm lượng ẩm trong rong nhỏ góp phần ức chế sự phát triển của vi sinh vật sống trên rong, ức chế quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa trong rong, từ đó rong được bảo quản tốt hơn, đảm bảo cho quá trình thực hiện không gặp gián đoạn về vấn đề nguyên liệu. Đồng thời khi hàm lượng ẩm nhỏ, tốc độ trích ly
tăng lên (do độ ẩm tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán).
- Rửa sạch:
Rong được rửa sạch nhằm loại bỏ tạp chất và muối bám dính trên rong, tạo điều kiện cho quá trình chiết và lọc được dễ dàng.
- Cắt nhỏ:
Sau khi rửa sạch, rong được làm ráo sơ bộ, rồi cắt hoặc băm nhỏ với kích thước thuận lợi cho quá trình chiết rút, mục đích là làm tăng diện tích tiếp xúc của rong nguyên liệu và dung môi, đồng thời phá vỡ cấu trúc tế bào rong, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi. Tuy nhiên, không nên xay hoặc nghiền rong quá nhỏ, bởi kích thước bột rong quá nhỏ sẽ làm cản trở quá trình lọc.
- Chiết rút:
Phlorotannin là hợp chất hữu cơ có khả năng tan trong một số dung môi phân cực và không phân cực. Các yếu tố dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết đều có ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của phlorotannin trong quá trình chiết. Vì vậy, tại công đoạn chiết, ta sẽ tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng chiết của phlorotannin.
+ Xác định ảnh hưởng của các dung môi khác nhau đến khả năng chiết phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa
Dung môi khảo sát: nước, methanol 50 %, ethanol 50 %, hexane, dichlomethane, buthanol, acetone, ethylaxetat. Tìm ra dung môi thích hợp. Lựa chọn dung môi theo 02 tiêu chí: Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa.
+ Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi
Khảo sát các tỉ lệ sau: 1:5, 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30; 1:35; 1:40; 1:45; 1:50 để xác định khả năng chiết rút của rong nguyên liệu vơí các lượng dung môi khác nhau, từ đó tìm ra tỉ lệ thích hợp nhất theo các tiêu chí: hoạt tính chống oxi hóa, khối lượng chất chiết, hàm lượng phlorotannin.
+ Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết.
Xác định nhiệt độ chiết hợp lý bằng cách khảo sát khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết ở các nhiệt độ khác nhau: 400C, 500C, 600C, 700C, 800C, 900C,
1000C, tìm ra nhiệt độ chiết thích hợp theo các tiêu chí: hoạt tính chống oxi hóa, khối lượng chất chiết, hàm lượng phlorotannin.
+ Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng chiết và hoạt tính của dung dịch chiết.
Khảo sát các khoảng thời gian: 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 phút. Tìm ra thời gian chiết thích hợp theo 02 tiêu chí: hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa.
- Lọc:
Sau khi chiết rút, tiến hành lọc thu hồi các chất hòa tan được trong dung môi, loại bỏ tạp chất không tan (cặn, bã rong).
- Chiết lỏng – lỏng:
Sau khi lọc sẽ thu được dịch chiết phlorotannin thô có chứa các chất hữu cơ như màu, acid béo, chất hữu cơ đi kèm phân cực và không phân cực. Chiết lỏng – lỏng sẽ giúp loại bỏ các chất đi kèm này, tạo điều kiện tốt hơn khi tiếp tục làm sạch bằng sắc kí cột.
- Làm sạch bằng sắc kí cột:
Mục đích của đề tài là thu phlorotannin theo định hướng sử dụng làm dược liệu, do đó đòi hỏi chế phẩm phải có độ tinh sạch nhất định. Phương pháp làm sạch bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp phụ là silicagel là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất ra khỏi hỗn hợp, thu lấy chế phẩm tinh theo yêu cầu.
CHƯƠNG II:
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Hình 2.1. Rong mơ Sargassum mcclurei
Loài rong mơ Sarrgassum mcclurei ở Việt Nam, chủ yếu ở vùng biển Nam Trung
bộ. Rong khi thu nhận đã được rửa qua nước biển và phơi khô trong bóng râm đến độ ẩm bảo quản.
Chủng loại sinh vật : Rong biển Ngành: Heterokontophyta (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lớp: Phaeophyceae
Bộ: Fucales
Họ: Sargassaceae
Chi: Sarrgassum
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Quy trình dự kiến để nghiên cứu tách chiết phlorotannin
Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát các nội dung nghiên cứu
- Kiểm tra sản phẩm bằng HPLC-MS - Thử nghiệm hoạt tính Làm tinh sạch bằng sắc kí cột Chế phẩm Phlorotannin Sấy phun Đánh giá sản phẩm Dịch chiết kỹ thuật Phlorotannin tinh Thử nghiệm hoạt tính Dịch chiết thô Chiết lỏng – lỏng Chọn dung môi thích hợp Rong nguyên liệu (khô)
Băm nhỏ
Chiết rút Rửa sạch
2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Các phương pháp phân tích hóa học và vật lý * Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldadl (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng lipid tổng bằng phương pháp Bligh và Dyer hỗn hợp chloroform/methanol. (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng iod theo phương pháp chuẩn độ (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng tro toàn phần bằng phương pháp trọng lượng (Phụ lục 1) * Xác định hàm lượng xơ thô theo Crudefibre và định lượng carbohydrate (Phụ lục 1) * Xác định hàm lượng alginate bằng phương pháp khối lượng (Phụ lục 1)
* Xác định fucoidan bằng phương pháp A.I.Usov (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết bằng phương pháp Mayalen Zubia [18]
Hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết được xác định bằng phương pháp so màu, dung thuốc thử Folin - Ciocalteu ở bước sóng 750 nm.
a. Nguyên lý
Oxi hóa toàn bộ lượng phlorotannin trong dịch chiết bằng dung dịch Folin - Ciocalteu ( hỗn hợp acid photphotungstic và acid phosphomolyblic). Các acid này sẽ bị khử thành vonfram (W8O23) và oxit molipden (Mo8O23) có màu xanh. Màu xanh được hấp thụ nhiều nhất ở bước sóng 750 nm.
b. Dụng cụ, hóa chất Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất:
- Dung dịch phloroglucin 0.1% làm chuẩn.
- Dung dịch thuốc thử Folin - Ciocalteu ( sản phẩm thương mại) - Na2CO3 10%
c. Tiến hành
- Chuẩn bị mẫu: Cân 0,05 g mẫu đã được đông khô, nghiền nhỏ rồi pha loãng 10 lần với nước cất. Lắc mạnh để hòa tan các chất trong dung dịch (dung dịch mẫu 1).
(dd mẫu 2)
- Chuẩn bị mẫu thử vào ống nghệm sạch:
Om: 1ml dd mẫu 2 + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 Pha loãng 10 lần dung dịch chuẩn C6H6O3 0,1% (dd chuẩn 1). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Lấy 5 ống thủy tinh sạch sau đó cho vào môi ống: C1: 0 ml dd chuẩn 1 + 1ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C2: 0.2 ml dd chuẩn 1 + 0.8ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C3: 0.4 ml dd chuẩn 1 + 0.6ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C4: 0.6 ml dd chuẩn 1 + 0.4ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C5: 1ml dd chuẩn 1 + 0ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3
- Sau khi đã chuẩn bị mẫu và chuẩn, đặt các ống nghiệm này trong bóng tối khoảng 60 - 90 phút.
- Sau khoảng thời gian trên quan sát ta thấy màu xanh đen xuất hiện và tiến hành so màu bằng máy quang phổ UV - Vis ở bước sóng 750 nm, ghi độ hấp thụ và tính toán xác định được lượng phlorotannin có trong mẫu thử.
2.2.2.2. Phương pháp cảm quan
Tiến hành đánh giá cảm quan dịch chiết theo phương pháp mô tả.
2.2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính
* Xác định hoạt tính chống oxi hóa tổng số
a. Nguyên lý
Hoạt tính oxi hóa tổng số được xác định theo phương pháp Prieto et al. (1999) [25]. b. Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất:
- Dung dịch thuốc thử (0,6 M sulfuric acid, 28 mM sodium phosphate và amoni 4mM molybdat)
c. Tiến hành
(0,6 M sulfuric acid, 28 mM sodium phosphate và amoni 4mM molybdat) được ủ ở 95°C trong 90 phút. Sau khi hỗn hợp đã được làm lạnh tới nhiệt độ phòng, độ hấp thụ được đo ở 695 nm bằng máy quang phổ UV - Vis.
Tất cả các kết quả đã được tính toán xác định thể hiện như acid ascorbic mg tương đương cho mỗi gram rong biển khô.
* Xác địnhhoạt tính khử sắt theo phương pháp Zhu, Chang, and Hsu (2000)[32]
a. Nguyên tắc
Hoạt tính khử sắt được xác định theo phương pháp của Zhu (2002) [12] . b. Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất:
- Dung dịch đệm phosphat (pH = 7,2)
- Dung dịch potassium ferricyanide 1% (w / v) - Dung dịch acid tricloaxetic (10%)
- Dung dịch sắt clorua c. Tiến hành
0,2 ml dịch chiết polyphenol đã được thêm vào 1.0 ml đệm phosphat (pH = 7,2) và 1,0 ml potassium ferricyanide 1% (w / v) và 0,8 ml nước cất. Các hỗn hợp phản ứng sau đó đã được ủ ở 50°C trong 20 phút. Sau đó, 1,0 ml acid tricloaxetic (10%) đã được thêm vào hỗn hợp trên. Hỗn hợp này được trộn với nước cất (0,6ml) và 0,16ml sắt clorua. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo tại 655nm của quang phổ UV-Vis (ELISA Reader, Bio-Rad, Mỹ).
Tất cả các kết quả được tính toán xác định thể hiện bằng mg Fe2 + tương đương với rong biển khô
* Xác định khả năng bắt gốc DPPH theo phương pháp phương pháp của Yên GC và Chen HY (1995)
a. Nguyên tắc
pháp của Yên GC và Chen HY (1995) b. Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dung dịch methanol c. Tiến hành
0,2ml, 0,4ml, 0,6ml, 0,8ml, 1,0ml dịch chiết rong được thêm vào 1ml nước cất, bổ sung 3,0ml DPPH 0,16mM trong methanol. Các hỗn hợp này sau đó được khuấy mạnh và để ở nhiệt độ phòng trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thụ của hỗn hợp mẫu dịch chiết sau đó đã được đo ở 517 nm bằng cách sử dụng quang phổ UV-Vis (ELISA Reader, Bio-Rad, Mỹ). Các mẫu trống được xử lý theo cách tương tự nhưng DPPH được thay bằng nước deionised. Mẫu kiểm soát đã được chuẩn bị theo cách tương tự nhưng dịch chiết được thay bằng nước deionised.
Tỉ lệ của DPPH được tính theo công thức:
100 ] ) ( 1 [ %= − − × control blank sample A A A Sc Trong đó:
Acontrol: độ hấp thụ của mẫu kiểm soát Asample: độ hấp thụ của mẫu dịch chiết Ablank: độ hấp thụ của mẫu trống.
Giá trị SC50 được tính toán từ đường cong đáp ứng của chương trình đường cong bảng.
2.2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
- Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh hóa, mỗi thí nghiệm làm 03 lần. Kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
- Sử dụng phần mềm Microsoft office Excel để xử lý số liệu.
Sắc kí lớp mỏng: được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết dựa vào sự có mặt của vết duy nhất hoặc vết chính là vết của đối tượng phân tích. Chất càng tinh khiết khi không có vết phụ hoặc vết phụ càng nhỏ.
Sắc kí lỏng hiệu năng cao: Sử dụng sắc kí lỏng iệu năng cao để xác định cụ thể
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định một số thành phần hóa học chủ yếu của rong nguyên liệu
Để đánh giá sơ bộ chất lượng của rong Sarrgassum mcclurei, chúng tôi tiến hành phân tích một số thành phần hóa học của nguyên liệu này và kết quả phân tích được chỉ ra trên bảng 3.1 như sau:
Bảng 3.1. Thành phần hóa học chính của rong nguyên liệu STT Thành phần Hàm lượng (% chất khô) STT Thành phần Hàm lượng (% chất khô) 1 Phlorotannin 0,138 6 Iod 0,01 2 Độ ẩm 25,8 7 Alginate 32,6 3 Tro 37,5 8 Laminaran 0,1
4 Protit thô 5,0 9 Fucoidan 2,0
5 Lipid 1,9
Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy hàm lượng phlorotannin rất nhỏ so với các chất khác như muối khoáng, alginate, protein,…Các chất có hàm lượng lớn như alginate, khoáng và các thành phần khác chiếm từ 0,1 đến 5,0 % như protein, fucoidan,. Những thành phần này có thể tan trong các loại dung môi phân cực, không phân cực. Nên khi chiết phlorotannin sẽ xảy ra đồng thời quá trình chiết các chất trên, dịch chiết thu được bao gồm phlorotannin và các chất chiết đi kèm, sự có mặt của những chất này trong dịch chiết chiếm một hàm lượng đáng kể. Vì vậy khi sử dụng hệ dung môi nước – cồn là dung môi đi kèm để chiết phlorotannin sẽ chiết theo một số chất đi kèm như khoáng, manitol, lipit, fucoidan, chlorophyll, alginate…. Để để tăng hàm lượng phlorotannin có hoạt tính chống oxi hóa chiết được và giảm các chất đi kèm, tiến hành lựa chọn một số thông số thích hợp.
3.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết phlorotannin từ rong nâu 3.2.1. Xác định ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết phlorotannin và hoạt 3.2.1. Xác định ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa
Theo các tài liệu mà chúng tôi nhận được thì chưa có công trình nghiên cứu nào đưa ra quy trình chung cho quá trình chiết phlorotannin từ rong biển mà các công bố chỉ đưa ra từng loại dung môi cụ thể đối với từng loài rong riêng biệt. Điều này là do
phlorotannin chiết từ loài rong khác nhau thì có cấu trúc khác nhau nhưng chúng đều là polyme sinh học tự nhiên được hình thành từ monome phloroglucinol và các monome này có thể liên kết với nhau qua nhiều kiểu liên kết khác nhau như aryl-aryl, liên kết ether, chính vì vậy khả năng hòa tan của chúng trong cùng loại dung môi là khác nhau.
Theo Ragan M. A và cộng sự [23] thì phlorotannin tan tốt trong dung môi phân cực, tuy nhiên với mỗi loại dung môi khác nhau thì khả năng tan của phlorotannin là khác nhau. Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau theo thứ tự độ phân cực tăng dần như sau: hexane, dichlomethane, ethyl acetate, acetone, buthanol, ethanol, methanol và nước nhằm mục đích tìm ra dung môi có khả năng chiết phlorotanin cao nhất mà vẫn giữ được hoạt tính của chúng.
Trong rong nâu, phlorotannin tồn tại trong màng tế bào thông qua liên kết cộng hóa trị với polysacharide, protein và theo số liệu bảng 3.1 thì hàm lượng các chất này cao gấp 4,16 lần hàm lượng phlorotannin. Điều này dẫn đến là khi chiết phlorotannin các chất chiết đi kèm luôn lớn hơn phlorotannin rất nhiều. Vì vậy khi khảo sát dung môi chiết một yếu tố quan trọng cần quan tâm là chất chiết khô.
Từ những lý do nêu trên, để lựa chọn dung môi chiết phlorotannin, chúng tôi dựa vào 03 yếu tố sau: khả năng chiết phlorotannin thể hiện bằng hàm lượng phlorotannin trong dich chiết, độ chọn lọc của dung môi thông qua tỉ lệ phlorotannin/chất chiết khô, hoạt tính oxi hóa. Vì vậy chúng tôi đánh giá khả năng chiết thông qua việc xác định hàm lượng chất khô, hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết ở cùng điều kiện chiết. Khi tiến hành thí nghiệm, cố định các thông số:
- Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: 1:20
- Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng (khoảng 25 - 300C)
- Thời gian chiết: 27h.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa của chất chiết
STT Dung môi mg chất chiết khô/