Ngâm với ethanol Cất thu hồi
Phân bố với nước
Chiết lần lượt với hexan, ethylacetate và butanol
Làm giàu bằng sắc kí cột silicagel
Sắc kí cột dùng silicagel
Hình 3.16. Sơ đồ quá trình tinh chế phlorotannin từ rong Sarrgassum vùng biển Nam Trung Bộ
Thuyết minh quá trình tinh chế:
1. Chiết phlorotannnin thô: Rong Sarrgassum mcclurei (10,0 kg), được phơi khô trong bóng râm, xay nhỏ và ngâm chiết với các điều kiện chiết đã được lựa chọn. Dịch chiết được cất loại dung môi, cho 1,214 g cao ethanol.
2. Phân bố cao ethanol trong nước, sau đó lắc lần lượt với n-hexan, ethylaxetate và n-butanol. Cất loại dung môi, cho 142, 291, 155 g các cặn dịch chiết tương ứng.
3. Cao chloroform được phân tách trên cột silicagel, dung môi giải hấp là chloroform : ethanol (100:0, 4:1; 1:1), cho 10 phân đoạn chính.
4. Phân đoạn 6 và 7 đem tinh chế lại bằng sắc kí cột silicagel, dung môi giải hấp là chloroform : ethanol (10:1, 5:1), cho 7 phân đoạn chính.
5. Phân đoạn 2, 3, 4 đem cất loại dung môi, đem tinh chế lại trong chloroform thu được phlorotannin sạch.
Rong khô 10 kg
Cao ethanol
Cao ethylaxetate
Phân đoạn 6, 7
Cao hexan Cao BuOH
Phân đoạn 2, 3, 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, cho phép rút ra kết luận như sau:
1.1. Các thông số thích hợp để thu nhận phlorotannin tinh, đạt tiêu chuẩn làm dược liệu:
* Thông số thích hợp cho quá trình chiết phlorotannin thô từ rong Sarrgassum
mcclurei vùng biển Nam Trung bộ:
- Dung môi chiết: cồn ethanol 90% (Tỉ lệ ethanol : nước = 9:1). - Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: 1: 20.
- Nhiệt độ chiết: 900C. - Thời gian chiết: 70 phút.
* Sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng, làm tinh sạch phlorotannin thô. Sau đó, tiếp tục tinh chế chế phẩm thu được bằng sắc kí cột sử dụng chất hấp thụ là silicagel.
* Kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm bằng phân tích HPLC và phân tích LC-MS. * Xác định hoạt tính chống oxi hóa cho thấy chế phẩm có hoạt tính chống oxi hóa tổng số, hoạt tính khử sắt và khả năng bắt gốc IC50 cao, có thể định hướng sử dụng làm dược liệu điều trị một số bệnh về tim mạch, lão hóa, ung thư,....
1.2. Chế phẩm thu được từ quá trình tinh chế phlorotannin từ rong Sarrgassum vùng biển Nam Trung Bộ có chứa hàm lượng phlorotannin cao, có khả năng triệt tiêu các gốc tự do, có hiệu quả chống oxi hóa và có độ sạch ở mức độ đạt tiêu chuẩn làm dược liệu. Như vậy có thể thấy, rong Sarrgassum vùng biển Nam Trung Bộ với chế phẩm phlorotannin có tiềm năng lớn làm nguyên liệu dược liệu.
2. Kiến nghị
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, cho phép đề xuất kiến nghị như sau:
- Có thể nghiên cứu thêm quy trình chiết phlorotannin ở các đối tượng rong khác nhau, có điều kiện sống khác nhau.
- Cần nghiên cứu khả năng ứng dụng rộng rãi của chế phẩm vào trong các lĩnh vực như: thực phẩm, dược phẩm, y học, mỹ phẩm,...Đặc biệt, kết hợp với ngành y tế, nghiên cứu sâu về vai trò của phlorotannin với sức khỏe con người như khả năng chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn,...từ đó có hướng sản xuất các sản phẩm cụ thể cung cấp cho thị trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đặng Xuân Cường (2009), Nghiên cứu thu nhận dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn
từ rong nâu Dictyota Dichotoma Việt Nam, luận văn thạc sỹ, Đại học Nha Trang.
2. Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn Tiến (1993),
Rong biển Việt Nam (phần phía Bắc), NXB KH & KT, HCM, 364 tr.
3. Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
4. Phạm Hoàng Hộ (1969), Rong biển Việt Nam, Trung tâm học liệu xuất bản.
5. Bùi Minh Lý, Trần Thị Luyến, Trần Thị Thanh Vân, Đặng Xuân Cường (2009), “Ảnh hưởng của các điều kiện chiết khác nhau tới hiệu suất chiết hỗn hợp phenol tổng trong rong nâu Dictyota dichotoma”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản, ISSN:1859-2252, 147-151.
6. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004),
Chế biến rong biển, NXB Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh.
7. Trần Thị Thanh Vân, Đặng Xuân Cường, Cao Thị Thúy Hằng, Võ Mai Như Hiếu
và Bùi Minh Lý (2009), Thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của dung
dịch chiết ethanol giàu iod tự nhiên từ rong nâu, Hội thảo về nghiên cứu phát triển
và ứng dụng công nghệ vật liệu KC02/06-10, Hà Nội.
Tiếng Anh
8. A. K. Swanson & L. D. Druehl. (2002), “Induction, exudation and the protective role of kelp phlorotannins”, Aquatic botany, 73, 241-253.
9. Alejandro Cabello-Pasini, Víctor Macías-Carranza, Roberto Abdala, Nathalie Korbee, Félix L. Figueroa (2011), “Effect of nitrate concentration and UVR on photosynthesis, respiration, nitrate reductase activity, and phenolic compounds in Ulva rigida (Chlorophyta)”, Journal of Applied Phycology, 23(3), 363-369.
10. Changjong Moon, Sung-Ho Kim, Jong-Choon Kim, Jin Won Hyun, Nam Ho Lee,
Jae Woo Park and Taekyun Shin (2008), “Protective effect of phlorotannin components phloroglucinol and eckol on radiation-induced intestinal injury in mice”, Phytotherapy Research, 22(2), 238–242.
11. Jormalainen, V., Honkanen, T., Koivikko, R. and Era ¨nen, (2003), “Induction of phlorotannin production in a brown alga: defense or resource dynamics?” – Oikos,
12. Hye Sook Kang, Hae Young Chung, Jee Hyung Jung, Byeng Wha Son and Jae Sue Choi (2003), “A new phlorotannin from the brown alga Ecklonia stolonifera”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 51(8), 1012-1014.
13. Hye Sook Kang, Hae Young Chung, Jee Hyung Jung, Byeng Wha Son and Jae Sue Choi (2004), “Inhibitory phlorotannins from the edible brown alga Ecklonia
stolonifera on total reactive oxigen species (ROS) generation”, Arch Pharm. Res.,
27(2), 194 – 198.
14. Leong, L. P., & Shui, G. (2002), An investigation of antioxidant capacity of fruits
in Singapore markets, Food Chemistry, 76, 69.
15. Dukmyung-Dong, Yuseong-Gu, Daejon (2004), “Seasonal variation of phlorotannin in sargassacean species from the coast of the Sea of Japan”, Livechem. Inc., 155(1), 305-320.
16. Mayalen Zubia, Claude Payri, Eric Deslandes, (2008), “Alginate, mannitol, phenolic compounds and biological activities of two range-extending brown algae,
Sargassum mangarevense and Turbinaria ornata (Phaeophyta: Fucales),from
Tahiti (French Polynesia)”, J. Appl. Phycol, 20, 1033–1043.
17. Murat Artan, Yong Li, Fatih Karadeniz, Sang-Hoon Lee, Moon-Moo Kim, Se- Kwon Kim (2008), Bioorganic & Medicinal Chemistry, 16, 7921–7926.
18. Kang K, Hwang HJ, Hong DH, Park Y, Kim SH, Lee BH, Shin HC (2004), “Antioxidant and antiinflammatory activites of ventol, a phlorotannin rich natural agent derived from Ecklonia cava and its effect on proteoglycan degradation in cartilage explane culture”, Res.Commun. Mol. Pathol. Pharmacol., 77, 115-116.
19. Karl-Werner Glombitza and Alexandra Schmidt (1999), “Nonhalogenated and Halogenated phlorotannins from the Brown Alga Carpophyllum angustifolium,
Institut für Pharmazeutische Biologie”, Universität Bonn, Nussallee 6, 53115 Bonn, Germany,J. Nat. Prod , 62, 1238–1240.
20. Koki Nagayama, Yoshitoshi Iwamura, Toshiyuki Shibata, Izumi Hirayama1 and Takashi Nakamura (2002), “Bactericidal activity of phlorotannins from the brown alga Ecklonia kurome”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 50, 889–893.
21. Kunihisa Iwai (2008), Plant Foods Hum Nutrition, 63, 163–169.
22. Prieto, P., Pineda, M., Aguilar, M., (1999), “Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: specific application to the determination of vitamin E”, Anal. Biochem., 269, 337–341.
24. Riitta Koivikko (2008), Brown algal phlorotannins improving and applying
chemical methods, Ph. D. Thesis, University of Turku, Turku, Finland.
25. Schoenwaelder, M. E. A. (2002), “The occurrence and cellular significance of physodes in brown algae”, Phycologia, 41, 125–139.
26. S. Kumar Chandini, P. Ganesan, N. Bhaskar(2008), “In vitro antioxidant activities of three selected brown seaweeds of India”, Food Chemistry, 107, 707–713.
27. Stéphane Cérantola, Florian Breton, Erwan Ar Gall, Eric Deslandes (2006), “Co- occurrence and antioxidant activities of fucol and fucophlorethol classes of polymeric phenols in Fucus spiralis”, Botanica Marina, 49(4), 347–351.
28. Takashi Kuda, Tomoko Hishi, Sayuri Maekawa (2006), “Antioxidant properties of dried product of “haba-nori”, an edible brown alga, Petalonia binghamiae (J. agaradh) Vinogradova”, Food Chemistry, 98, 545–550.
29. Yang, Huicheng; Zeng, Mingyong; Dong, Shiyuan; Liu, Zunying; Li, Ruixue, “Anti-proliferative activity of phlorotannin extracts from brown algae Laminaria japonica Aresch, Chinese Journal of Oceanology and Limnology”, 28(1), 122-130.
30. Young Min Ham, Jong Seok Baik, Jin Won Hyun, and Nam Ho Lee (2007), “Isolation of a New phlorotannin, Fucodiphlorethol G, from a Brown Alga
Ecklonia cava”, Bull. Korean Chem. Soc., 28(9), 1595.
31. Yoshimasa Sugiura, Kohji Matsuda, Yasuhiro Yamada, Kunio Imai, Makoto Kakinuma and Hideomi Amano (2008), “Radical Scavenging and Hyaluronidase Inhibitory Activities of phlorotannins from the Edible Brown Alga Eisenia
arborea”, Food Science and Technology Research, 14(6), pp.595.
32. Zhu, Q.Y., Hackman, R.M., Ensunsa, J.L., Holt, R.R., Keen, C.L., J. Agric (2002), “Antioxidative activities of Oolong tea”, Food Chem.,50, 6929 – 6934.
Trang websites
PHỤ LỤC 1 - CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Các phương pháp phân tích hóa học và vật lý
- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy - Xác định độ ẩm theo TCVN 1867:2001
- Xác định hàm lượng khoáng theo TCVN 4329-86
- Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldadl
-Xác định hàm lượng lipid tổng bằng phương pháp Bligh và Dyer hỗn hợp chloroform/methanol.
- Xác định hàm lượng iod theo phương pháp chuẩn độ
- Xác định hàm lượng tro toàn phần bằng phương pháp trọng lượng - Xác định hàm lượng xơ thô theo Crudefibre và định lượng carbohydrate
- Xác định hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết bằng phương pháp Mayalen Zubia [16]
- Xác định hàm lượng alginate bằng phương pháp khối lượng - Xác định fucoidan bằng phương pháp A.I.Usov
- Xác định kim loại nặng theo TCVN 5779:1990 (As), TCVN 5780:1990 (Pb). TCVN 5152:1990 (Hg), AOAC 945.58 (Cd)
2. Phương pháp cảm quan
Tiến hành đánh giá cảm quan dịch chiết theo phương pháp mô tả.
3. Phương pháp thử hoạt tính
* Thử hoạt tính chống oxi hóa gồm các phương pháp sau:
- Hoạt tính oxi hóa tổng số theo phương pháp Prieto et al. (1999) [22] - Hoạt tính khử sắt theo phương pháp Zhu, Chang, and Hsu (2000) [32]
- Khả năng bắt gốc DPPH theo phương pháp của Yên GC và Chen HY (1995) * Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp đĩa giấy trên thạch
* Xác định các chỉ tiêu vi sinh
- Phương pháp lấy mẫu: TCVN 6400:1998.
- Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí : TCVN 5165 :90 - Xác định Escherichia coli : TCVN 6505-1 :1999. - Xác định Staphylococcus aureus: TCVN 4830:89. - Xác định Salmonella: TCVN 6402:1998. - Xác định nấm men, nấm mốc: TCVN 6265:1997. -Enterobacteria 5518-2-2997
* Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy
a. Nguyên lý
Dùng nhiệt độ cao để làm bay hết hơi nước trong mẫu thử, sau đó dựa vào hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô, từ đó tính được hàm lượng nước trong thực phẩm (%).
b. Dụng cụ, hóa chất
- Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ. - Cân phân tích độ chính xác 10-4g - Cốc sấy bằng thủy tinh
- Đũa thủy tinh - Bình hút ẩm c. Tiến hành
Sấy cốc đến khối lượng không đổi. Cốc được rửa sạch, úp khô, sấy ở nhiệt độ 100- 1500C trong khoảng 1h, sau đó lấy ra, làm nguội trong bình hút ẩm rồi mang đi cân và sấy tiếp ở nhiệt độ trên, làm nguội trong bình hút ẩm và cân đến khi nào giữa 2 lần liên tiếp, sai khác khối lượng không quá 5.10-4g là được (sấy đến khối lượng không đổi).
Cân chính xác một khối lượng rong đã cắt nhỏ (khoảng 10g), vào cốc đã sấy khô, đến khối lượng không đổi. Dùng đũa thủy tinh đánh tơi mẫu, dàn đều mẫu trên đáy cốc. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở 60-800C, trong 2h. Sau đó nâng nhiệt độ lên 100-1500C, sấy liên tục trong 3h. Chú ý trong quá trình sấy cứ sau 1h, đảo mẫu 1 lần. Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm, sau đó mang cân trên cân phân tích, rồi sấy tiếp ở nhiệt độ 100-1500C đến khối lượng không đổi như trên.
d. Tính kết quả:
Độ ẩm của rong được tính theo công thức:
X = G1-G2/G1-G x 100% Trong đó, X: Độ ẩm (hàm lượng nước) của rong(%)
G1: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử trước khi sấy (g) G2: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử sau khi sấy (g) G: Khối lượng cốc sấy (g)
* Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldadl
Từ hàm lượng ni tơ định lượng được theo phương pháp Kjeldadl, nhân với hệ số 6,25 sẽ tính được hàm lượng protein trong mẫu rong.
a. Nguyên lý
Để xác định đạm tổng quát trong thực phẩm, người ta dùng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác đặc biệt là hỗn hợp CuSO4 và K2SO4 theo tỉ lệ 1/10 để vô cơ hóa, mục đích để chuyển toàn bộ ni tơ trong thực phẩm về dạng muối (NH4)2SO4. Sau đó dùng NaOH đặc để lấy NH3 ra và dùng hơi nước lôi cuốn NH3 ra khỏi thiết bị chưng cất vào cốc hứng chứa H2SO4 0,1N dư, cuối cùng dùng NaOH 0,1N chuẩn độ lại H2SO4 dư.
b. Cách tiến hành
- Lấy chính xác 2g mẫu rong đã cắt nhỏ vào bình Kjeldadl. Thêm 4 g hỗn hợp chất xúc tác CuSO4 và K2SO4 và 20 ml H2SO4 đậm đặc để nghiêng trên bếp điện đun từ từ. Trong quá trình vô cơ hóa màu sắc của mẫu chuyển từ màu nâu đen sang màu xanh trong hoặc không màu là được.
Chú ý: Trong quá trình vô cơ nếu mẫu chưa đạt đến màu xanh trong mà dung dịch bị cạn thì lấy bình ra, để nguội và thêm vào 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc rồi tiếp tục vô cơ.
Khi vô cơ hóa mẫu, tránh hiện tượng sôi mẫu quá mạnh, để bắn ra ngoài gây sai số, phải vô cơ triệt để hoàn toàn.
- Rửa thiết bị chưng cất: Tiến hành sục rửa thiết bị chưng cất và kiểm tra các khớp nối phải đảm bảo sạch và kín.
- Chuẩn bị cốc hứng: Lấy cốc thủy tinh 250 ml sạch, cho vào cốc hứng 25 ml dung dịch H2SO4 0.1 N và vài giọt methyl đỏ 0.1%. Đặt cốc hứng ngập dưới đầu ống sinh hàn của thiết bị chưng cất.
- Chưng cất và chuẩn độ: Cho mẫu đã vô cơ hóa vào bình chưng cất của thiết bị, tráng bình Kjeldadl vài lần bằng nước cất để lấy hết mẫu thử đã vô cơ hóa, dịch tráng đó cũng chuyển cả vào bình chưng cất. Thêm vài giọt phenolphtalein 1% và cho từ từ dung dịch NaOH 40% cho tới khi có màu đỏ ( hoặc tím đỏ), tráng phễu bằng nước cất. Đậy kín các khớp nối và tiến hành chưng cất lôi cuốn NH3 bằng hơi nước cho đến khi hết NH3 trong bình chưng cất (thử bằng giấy đo pH). Định lượng trực tiếp NH3 bay ra bằng H2SO4 0.1N dư trong cốc hứng, sau đó dùng NaOH 0,1 N chuẩn độ lại lượng H2SO4 0,1N dư trong cốc hứng đến khi dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu vàng nhạt là được.
c. Tính kết quả
Hàm lượng đạm toàn phần tính theo công thức sau: Ntp = 0.0014 x ( A - B) x 100/P (%)
Trong đó:
A: Số ml H2SO4 0,1 N dùng trong cốc hứng B: Số ml NaOH 0,1N dùng trong chuẩn độ. P: Khối lượng mẫu thử (mẫu rắn) (g)
0,0014: Số g ni tơ tương ứng với 1ml H2SO4 0,1N
Hàm lượng protein trong rong được tính theo công thức sau: XP = Ntpx6,25 (%)
* Xác định hàm lượng lipid tổng bằng phương pháp Bligh và Dyer hỗn hợp chloroform/methanol.
a. Nguyên lý
Giải phóng lipid từ các hợp chất với protein và gluxid nhờ thủy phân bằng chloroform CHCl3 ở môi trường có cồn CH3OH.
b. Dụng cụ hóa chất
Sử dụng dụng cụ, hóa chất thông thường của phòng thí nghiệm. c. Tiến hành
Cân 50 - 100 g mẫu rong hay bã rong được nghiền nhỏ trong máy xay rồi đem ngâm chiết trong CHCl3 : CH3OH tỉ lệ 1: 2 ( 100ml CHCl3 : 200ml CH3OH ) và ngâm trong 6h (chiết 2 lần). Bổ sung 100ml CH3Cl, sau đó thêm 100ml nước vào lắc đều, phân lớp, lấy phần dung dịch ở phía dưới, rửa lại bằng nước 2 lần, sau đó đem làm khan bằng Na2SO4, dịch chiết thu được đem cô cất, loại dung môi trên máy quay cất chân không ở 40 0C và áp suất 25tor. Hàm lượng dầu béo thu được sau khi cân trên cân phân tích Sorturios analytic và được tính toán theo phần trăm khối lượng so với mẫu ban đầu.
d. Tính kết quả:
Hàm lượng lipid (%) tính theo công thức sau: A = p x 100/ G (%) Trong đó:
A: Hàm lượng lipd trong mẫu thử (%) p: Khối lượng lipid đem cân (g) G: Khối lượng mẫu thử (g)
* Xác định hàm lượng iod theo phương pháp chuẩn độ