2.2.2.1. Các phương pháp phân tích hóa học và vật lý * Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldadl (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng lipid tổng bằng phương pháp Bligh và Dyer hỗn hợp chloroform/methanol. (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng iod theo phương pháp chuẩn độ (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng tro toàn phần bằng phương pháp trọng lượng (Phụ lục 1) * Xác định hàm lượng xơ thô theo Crudefibre và định lượng carbohydrate (Phụ lục 1) * Xác định hàm lượng alginate bằng phương pháp khối lượng (Phụ lục 1)
* Xác định fucoidan bằng phương pháp A.I.Usov (Phụ lục 1)
* Xác định hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết bằng phương pháp Mayalen Zubia [18]
Hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết được xác định bằng phương pháp so màu, dung thuốc thử Folin - Ciocalteu ở bước sóng 750 nm.
a. Nguyên lý
Oxi hóa toàn bộ lượng phlorotannin trong dịch chiết bằng dung dịch Folin - Ciocalteu ( hỗn hợp acid photphotungstic và acid phosphomolyblic). Các acid này sẽ bị khử thành vonfram (W8O23) và oxit molipden (Mo8O23) có màu xanh. Màu xanh được hấp thụ nhiều nhất ở bước sóng 750 nm.
b. Dụng cụ, hóa chất Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất:
- Dung dịch phloroglucin 0.1% làm chuẩn.
- Dung dịch thuốc thử Folin - Ciocalteu ( sản phẩm thương mại) - Na2CO3 10%
c. Tiến hành
- Chuẩn bị mẫu: Cân 0,05 g mẫu đã được đông khô, nghiền nhỏ rồi pha loãng 10 lần với nước cất. Lắc mạnh để hòa tan các chất trong dung dịch (dung dịch mẫu 1).
(dd mẫu 2)
- Chuẩn bị mẫu thử vào ống nghệm sạch:
Om: 1ml dd mẫu 2 + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 Pha loãng 10 lần dung dịch chuẩn C6H6O3 0,1% (dd chuẩn 1).
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Lấy 5 ống thủy tinh sạch sau đó cho vào môi ống: C1: 0 ml dd chuẩn 1 + 1ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C2: 0.2 ml dd chuẩn 1 + 0.8ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C3: 0.4 ml dd chuẩn 1 + 0.6ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C4: 0.6 ml dd chuẩn 1 + 0.4ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3 C5: 1ml dd chuẩn 1 + 0ml nước cất + 2ml Folin - Ciocalteu (sau 3 phút) + 4ml Na2CO3
- Sau khi đã chuẩn bị mẫu và chuẩn, đặt các ống nghiệm này trong bóng tối khoảng 60 - 90 phút.
- Sau khoảng thời gian trên quan sát ta thấy màu xanh đen xuất hiện và tiến hành so màu bằng máy quang phổ UV - Vis ở bước sóng 750 nm, ghi độ hấp thụ và tính toán xác định được lượng phlorotannin có trong mẫu thử.
2.2.2.2. Phương pháp cảm quan
Tiến hành đánh giá cảm quan dịch chiết theo phương pháp mô tả.
2.2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính
* Xác định hoạt tính chống oxi hóa tổng số
a. Nguyên lý
Hoạt tính oxi hóa tổng số được xác định theo phương pháp Prieto et al. (1999) [25]. b. Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất:
- Dung dịch thuốc thử (0,6 M sulfuric acid, 28 mM sodium phosphate và amoni 4mM molybdat)
c. Tiến hành
(0,6 M sulfuric acid, 28 mM sodium phosphate và amoni 4mM molybdat) được ủ ở 95°C trong 90 phút. Sau khi hỗn hợp đã được làm lạnh tới nhiệt độ phòng, độ hấp thụ được đo ở 695 nm bằng máy quang phổ UV - Vis.
Tất cả các kết quả đã được tính toán xác định thể hiện như acid ascorbic mg tương đương cho mỗi gram rong biển khô.
* Xác địnhhoạt tính khử sắt theo phương pháp Zhu, Chang, and Hsu (2000)[32]
a. Nguyên tắc
Hoạt tính khử sắt được xác định theo phương pháp của Zhu (2002) [12] . b. Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất:
- Dung dịch đệm phosphat (pH = 7,2)
- Dung dịch potassium ferricyanide 1% (w / v) - Dung dịch acid tricloaxetic (10%)
- Dung dịch sắt clorua c. Tiến hành
0,2 ml dịch chiết polyphenol đã được thêm vào 1.0 ml đệm phosphat (pH = 7,2) và 1,0 ml potassium ferricyanide 1% (w / v) và 0,8 ml nước cất. Các hỗn hợp phản ứng sau đó đã được ủ ở 50°C trong 20 phút. Sau đó, 1,0 ml acid tricloaxetic (10%) đã được thêm vào hỗn hợp trên. Hỗn hợp này được trộn với nước cất (0,6ml) và 0,16ml sắt clorua. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo tại 655nm của quang phổ UV-Vis (ELISA Reader, Bio-Rad, Mỹ).
Tất cả các kết quả được tính toán xác định thể hiện bằng mg Fe2 + tương đương với rong biển khô
* Xác định khả năng bắt gốc DPPH theo phương pháp phương pháp của Yên GC và Chen HY (1995)
a. Nguyên tắc
pháp của Yên GC và Chen HY (1995) b. Dụng cụ, hóa chất
Dụng cụ:
- Máy quang phổ UV - Vis - Pipes 0.5, 1 , 2, 5, 10 ml - Bình định mức 100ml. Hóa chất:
- Dung dịch methanol c. Tiến hành
0,2ml, 0,4ml, 0,6ml, 0,8ml, 1,0ml dịch chiết rong được thêm vào 1ml nước cất, bổ sung 3,0ml DPPH 0,16mM trong methanol. Các hỗn hợp này sau đó được khuấy mạnh và để ở nhiệt độ phòng trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thụ của hỗn hợp mẫu dịch chiết sau đó đã được đo ở 517 nm bằng cách sử dụng quang phổ UV-Vis (ELISA Reader, Bio-Rad, Mỹ). Các mẫu trống được xử lý theo cách tương tự nhưng DPPH được thay bằng nước deionised. Mẫu kiểm soát đã được chuẩn bị theo cách tương tự nhưng dịch chiết được thay bằng nước deionised.
Tỉ lệ của DPPH được tính theo công thức:
100 ] ) ( 1 [ %= − − × control blank sample A A A Sc Trong đó:
Acontrol: độ hấp thụ của mẫu kiểm soát Asample: độ hấp thụ của mẫu dịch chiết Ablank: độ hấp thụ của mẫu trống.
Giá trị SC50 được tính toán từ đường cong đáp ứng của chương trình đường cong bảng.
2.2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
- Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh hóa, mỗi thí nghiệm làm 03 lần. Kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
- Sử dụng phần mềm Microsoft office Excel để xử lý số liệu.
Sắc kí lớp mỏng: được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết dựa vào sự có mặt của vết duy nhất hoặc vết chính là vết của đối tượng phân tích. Chất càng tinh khiết khi không có vết phụ hoặc vết phụ càng nhỏ.
Sắc kí lỏng hiệu năng cao: Sử dụng sắc kí lỏng iệu năng cao để xác định cụ thể
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định một số thành phần hóa học chủ yếu của rong nguyên liệu
Để đánh giá sơ bộ chất lượng của rong Sarrgassum mcclurei, chúng tôi tiến hành phân tích một số thành phần hóa học của nguyên liệu này và kết quả phân tích được chỉ ra trên bảng 3.1 như sau:
Bảng 3.1. Thành phần hóa học chính của rong nguyên liệu STT Thành phần Hàm lượng (% chất khô) STT Thành phần Hàm lượng (% chất khô) 1 Phlorotannin 0,138 6 Iod 0,01 2 Độ ẩm 25,8 7 Alginate 32,6 3 Tro 37,5 8 Laminaran 0,1
4 Protit thô 5,0 9 Fucoidan 2,0
5 Lipid 1,9
Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy hàm lượng phlorotannin rất nhỏ so với các chất khác như muối khoáng, alginate, protein,…Các chất có hàm lượng lớn như alginate, khoáng và các thành phần khác chiếm từ 0,1 đến 5,0 % như protein, fucoidan,. Những thành phần này có thể tan trong các loại dung môi phân cực, không phân cực. Nên khi chiết phlorotannin sẽ xảy ra đồng thời quá trình chiết các chất trên, dịch chiết thu được bao gồm phlorotannin và các chất chiết đi kèm, sự có mặt của những chất này trong dịch chiết chiếm một hàm lượng đáng kể. Vì vậy khi sử dụng hệ dung môi nước – cồn là dung môi đi kèm để chiết phlorotannin sẽ chiết theo một số chất đi kèm như khoáng, manitol, lipit, fucoidan, chlorophyll, alginate…. Để để tăng hàm lượng phlorotannin có hoạt tính chống oxi hóa chiết được và giảm các chất đi kèm, tiến hành lựa chọn một số thông số thích hợp.
3.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết phlorotannin từ rong nâu 3.2.1. Xác định ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết phlorotannin và hoạt 3.2.1. Xác định ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa
Theo các tài liệu mà chúng tôi nhận được thì chưa có công trình nghiên cứu nào đưa ra quy trình chung cho quá trình chiết phlorotannin từ rong biển mà các công bố chỉ đưa ra từng loại dung môi cụ thể đối với từng loài rong riêng biệt. Điều này là do
phlorotannin chiết từ loài rong khác nhau thì có cấu trúc khác nhau nhưng chúng đều là polyme sinh học tự nhiên được hình thành từ monome phloroglucinol và các monome này có thể liên kết với nhau qua nhiều kiểu liên kết khác nhau như aryl-aryl, liên kết ether, chính vì vậy khả năng hòa tan của chúng trong cùng loại dung môi là khác nhau.
Theo Ragan M. A và cộng sự [23] thì phlorotannin tan tốt trong dung môi phân cực, tuy nhiên với mỗi loại dung môi khác nhau thì khả năng tan của phlorotannin là khác nhau. Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau theo thứ tự độ phân cực tăng dần như sau: hexane, dichlomethane, ethyl acetate, acetone, buthanol, ethanol, methanol và nước nhằm mục đích tìm ra dung môi có khả năng chiết phlorotanin cao nhất mà vẫn giữ được hoạt tính của chúng.
Trong rong nâu, phlorotannin tồn tại trong màng tế bào thông qua liên kết cộng hóa trị với polysacharide, protein và theo số liệu bảng 3.1 thì hàm lượng các chất này cao gấp 4,16 lần hàm lượng phlorotannin. Điều này dẫn đến là khi chiết phlorotannin các chất chiết đi kèm luôn lớn hơn phlorotannin rất nhiều. Vì vậy khi khảo sát dung môi chiết một yếu tố quan trọng cần quan tâm là chất chiết khô.
Từ những lý do nêu trên, để lựa chọn dung môi chiết phlorotannin, chúng tôi dựa vào 03 yếu tố sau: khả năng chiết phlorotannin thể hiện bằng hàm lượng phlorotannin trong dich chiết, độ chọn lọc của dung môi thông qua tỉ lệ phlorotannin/chất chiết khô, hoạt tính oxi hóa. Vì vậy chúng tôi đánh giá khả năng chiết thông qua việc xác định hàm lượng chất khô, hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết ở cùng điều kiện chiết. Khi tiến hành thí nghiệm, cố định các thông số:
- Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: 1:20
- Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng (khoảng 25 - 300C)
- Thời gian chiết: 27h.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa của chất chiết
STT Dung môi mg chất chiết khô/ g rong Hàm lượng phlorotannin trong dịch chiết (mg) Tổng số mg acid ascorbic/ g rong Tổng số mg Fe / g rong 1 Hexane 18,6 0,146 0,48 0,54 2 Dichloromethane 37,2 0,448 1,104 0.88 3 Ethyl acetate 13,5 0,76 2,54 2,6 4 Acetone 13,5 0,76 2,54 2,6 5 Buthanol 46,5 0,264 1,85 1,46 6 Ethanol 50% 52,9 1,29 1,39 2,26 7 Methanol 50% 60,2 1,68 1,316 2,06 8 Nước 152,1 3,34 6,6 15,22
Nhận xét: Từ kết quả nghiên cứu bảng 3.2 cho ta thấy dung môi chiết có ảnh hưởng đến khối lượng chất chiết khô và hàm lượng phlorotannin có trong dịch cũng như hoạt tính chống oxi hóa của chúng.
Các dung môi phân cực như acetone, ethanol 50%, methanol 50% và nước đều
có khả năng chiết phlorotannin. Tuy nhiên độ chọn lọc không cao trừ dung môi acetone (độ chọn lọc của nước là 3,34/152,1, ethanol 50% là 1,29/52,9, của methanol 50% là 1,68/60,2, của acetone là 0,76/13,5) và hoạt tính chống oxi hóa tăng cùng sự tăng độ phân cực của dung môi (hoạt tính chống oxi hoá tổng số của của nước là 6,6 mg acid ascorbic/g rong, acetone là 2,54 mg acid ascorbic/g rong, của ethanol 50% là 1,39 mg acid ascorbic/g rong, của methanol 50% là 1,316 mg acid ascorbic/g rong,). Như vậy có thể thấy khả năng chiết phlorotannin của các dung môi phân cực tăng theo thứ tự sau: nước > acetone > ethanol 50% > methanol 50% và độ chọn lọc của dung môi theo thứ tự acetone > methanol 50% > ethanol 50% > nước. Có thể giải thích điều này do:
- Khi chiết bằng nước, nước là dung môi có tính phân cực mạnh nên ngoài khả năng hòa tan phlorotannin, nó còn có thể hòa tan được nhiều thành phần hóa học khác trong rong nguyên liệu, đặc biệt là những thành phần tan được trong nước lại chiếm một phần lớn. Chính vì vậy, lượng chất chiết khô trong môi trường nước là lớn nhất.
- Khi chiết bằng các dung môi phân cực còn lại, độ phân cực giảm dần thì đồng thời khả năng hòa tan các chất cũng giảm, do đó, lượng chất chiết khô thu được cũng giảm dần và chỉ có một lượng nhỏ phlorotannin được hòa tan.
Từ bảng 3.2. cho thấy tất cả dịch chiết thu được khi sử dụng các dung môi khác nhau đều thể hiện hoạt tính chống oxi hóa thông qua 2 thông số là hoạt tính chống oxi hóa tổng số tính theo mg acid ascorbic/g rong và hoạt tính khử sắt tính theo mg sắt/g rong. Tùy theo hệ dung môi khác nhau mà hoạt tính chống oxi hóa có giá trị khác nhau. Hoạt tính chống oxi hóa tổng số và khả năng khử của chất chiết tăng theo thứ tự nước > methanol > ethanol > acetone.
Trong khi đó khả năng chiết phlorotannin không theo thứ tự như trên. Kết quả này cho thấy hoạt tính chống oxi hóa trong rong Sargassum mcclurei ít liên quan đến hàm lượng chất phlorotannin. Như vậy, trong rong Sargassum mcclurei ngoài phlorotannin còn có một số hợp chất khác cũng có hoạt tính chống oxi hóa khác và các chất này cũng tan trong các dung môi phân cực. Mục đích của đề tài là thu được chất chiết từ rong Sargassum mcclureivừa có chứa hợp chất phlorotannin vừa có hoạt tính chống oxi hóa cao. Theo kết quả ở trên thu được, hoạt tính chống oxi hóa tổng số khi chiết bằng ethyl acetate và acetone là 2,54 mg acid ascorbic/g rong, cồn methanol 50% là 1,316 mg acid ascorbic/g rong, trong khi đó, hoạt tính chống oxi hóa tổng số khi chiết bằng cồn methanol 50% là 1,39 mg acid ascorbic/g rong. Tuy nhiên, việc sử dụng dung môi cồn ethanol nhìn chung có chi phí tương đối thấp hơn đồng thời cũng ít độc hại hơn so với các dung môi khác. Do đó, lựa chọn hệ ethanol là dung môi cho việc tách chiết phlorotannin từ rong Sargassum mcclurei sẽ hợp lý hơn. Vì vậy chúng tôi lựa chọn dung môi là cồn ethanol.
3.2.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi ethanol : nước
Sau khi chọn được hệ dung môi chiết thích hợp là cồn ethanol, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ ethanol : nước lên khả năng chiết phlorotannin và hoạt tính chống oxi hóa của hệ dung môi này.
Khi tiến hành thí nghiệm, cố định các thông số: - Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng (khoảng 25 - 300C). - Thời gian chiết: 27h.
- Dung môi cồn ethanol nồng độ khác nhau.
Vì quá trình chiết phlorotannin có các chất chiết đi kèm như fucoidan, alginate, manitol,… mà theo tác giả T. N. Zvyagintseva và cộng sự thì polyuromanan tủa khi
nồng độ cồn > 20%, fucoidan tủa khi nồng độ cồn ≥ 60%. Vì vậy để loại bỏ các polysacharide tan trong nước bị chiết cùng phlorotannin, chúng tôi chỉ khảo sát nồng độ cồn tại các nồng độ 60%, 70%, 80%, 90% và 100% điều kiện chiết là nhiệt độ 400C, thời gian chiết 24 giờ. Kết quả phân tích dung dịch chiết được chỉ ra trên hình 3.1, hình 3.2, bảng 3.3 (Phụ lục 3). 0 10 20 30 40 50 60 60 70 80 90 100
Dung môi ethanol (%)
C h ấ t c h iế t k h ô ( m g ) 0 0.5 1