2. Î.1.2 Hóa chất thực nghiệm
2.2.3.Quy trình chiết tách protein —leptin từ tai lơn tạo chế phẫm dungdịch và chế phẫm đông khô
chế phẫm đông khô
2.23.1, Quy trình chỉết (ách protein - teptin từ tai lợn:
Tai lợn (đã nghiền nhuyễn)
Khuấy trong 5 phút với Dung dịch đệm Hon dịch tai lợn Tủa (bỏ) Đóng khô —► Ly tâm ỈOOOOv/ph X 30 Phút, (fc Lóp dung dịch Chế phẩm leptỉn thô (GF)
Kết tủa bằng amonỉsuỉphat, ly tâm lữ000v/ph X 30 phút,0°c
Ket tủa
Mô tả quy trình
• Giai đoạn 1: Gỉ ai đoạn tách loại tạp chất
• <• • • 1
Tai lợn sau khi được xay nhuyễn được pha theo tỷ lệ lg taỉ lợn trong 3ml dung dịch đệm thích hợp. Khuấy đều trong 5 phút để leptin tan hoàn toàn trong nước. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 10000 vòng/phút trong 30 phủt ở 0°c để chất béo đông đặc lại. Lấy phần dịch lỏng.
• Giai đoạn 2: Giai đoạn kết tủa protein — leptìn
Hút lấy dung dịch thu được vào ống [y tâm. Vừa khuấy vừa thêm amonisuỉfate vảo đến nồng độ thích hợp. Đe 15-20 phút để sự kết tủa đạt đến ổn đinh. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 3Q phủt ở 0°c, thu kết tủa.
Tủa đem đông khô tạo thành chế phẩm thô (CF hay chế phẩm đông khô).
• Giai đoạn 3: Giai đoạn lọc gel tinh chế Leptin [3J,[25/,f27j.
Thực hiện sắc ký lọc gel với dung dịch có chứa các protein đã biết khối lượng phân tử đê xây dựng đường chuẩn phụ thuộc giữa khối lượng phân tử (MW) và Ihể tích rửa giải (Ve). Sau đó nạp dung dịch leptin thô đế thu được các phân đoạn tương ứng với MW từ 15000 - lóOOODa.
2.2.3.2. Chiết tách protein — ỉeptin ớ 3 vùng pH Thăm dò duitg môi hòa tan:
- Trong tai lợn cỏ Ị lượng chất béo không tan trong nước gây khó khăn cho quá trình chiết tách, xác đinh nồng độ của leptin trong tai lợn. Do đó chúng tôi tiến hành loại tạp ca học bằng cách pha loãng hỗn hợp tai lợn xay nhuyễn với dung dịch đệm thích hợp và ly tâin dế loại tạp sa bộ.
- Chúng tôi sử dụng 3 loại dung dịch đệm acetat pH 5, đung địch đệm phosphat pH 7 và dưng dịch đệm carbonat pH 9 đế pha loãng theo tỉ lệ lg tai lợn : 3mỉ dung dịch đệm. Khuấy đều trong 5 phút đế leptin hòa tan hoàn toàn. Ly tâm hỗn hợp bằng máy ly tâm lạnh với tốc độ 10000
vòng/ phút. Ở 0(lc để các tạp cơ học và chất béo lắng xuống. Tiến hành đo quang vả nồng độ protein của hỗn hợp thu được? kết quả đirực tóm tắt trong bảng 2.3
Protein tổng sô(mg)
pH 5 pH 7 pH9