2. Î.1.2 Hóa chất thực nghiệm
2.2.2. Xây dựng đuòng chuấn đế xác định khối ]uọ‘ng phân tử
> Chuẩn bị cột sắc ký:
- Ngâm sepliadex 075 trong dung dịch NaN.10,02% trong 24 giờ đé gel trương nở hoàn
toàn. Dùng một lượng nước sao cho khi trương nở và gel đã lắng xuống lượng nước thừa
phải có thể tích gấp 10 lần thể tích gel.
- Cho một ít dung địch đệm vào cột.
- Cho một lớp bông thủy tinh vào đáy cột.
- Để cột thật thẳng, đổ dung môi vảo tới 1/3 chỉều cao của cột, tránh bọt.
- Gel đã trương đổ vào cột bằng đũa thủy tinh, Khi được một lớp gel đã lắng xuống khoảng vào cm, mở khóa đáy cột cho dung môi từ từ chảy ra. Tiếp tục đổ gel vào, chú ý sao cho quá trình đổ luôn có 3 lớp: lớp dưới là geỉ đã lắng, lớp này ngày càng cao dần; ở giữa là lớp gel
đang lắng; còn phía trên là lórp dung dịch trong suốt. Nếu quá trình lắng nhanh hơn lưu lượng chảy có thể thỉnh thoảng hút bỏ lớp dung môi phía trên để có thể tiếp tục đố gel vào. Làm như trên cột gel sẽ đồng đều không có chồ thưa chỗ đặc.
- Đặt lên gel một miếng giấy lọc.
- Cho dung môi chảy trong vài giờ để ổn định cột.
y Nạp mau:
- Pha đung dịch mẫu đến nồng độ khoảng 1 Omg protein/ml.
- Hút bỏ phần dung môi trên cột gel.
- Mở khóa dưới cột cho chảy tiêp tới khi mực nước xuông sát lớp gel.
- Đổ dưng môi tới độ cao cần thiết.
> Thu mẫu:
- Thu vào mỗi ống nghiệm, mỗi ống chửa 1 mỉ. Thu các phân đoạn có sự hiện
diện của protein tương ứng với MW của nó (theo đường chuẩn đã dựng) đe
xác định hàm lượng leptin.
Kết quả: Kết quả rửa giải các protein đưạc trinh bảy trong bảng 2.
Vitamin 2Bàng 2.2: Kết quá rửa giai các protein bằng p lĩ ương pháp lọc gel
Hình 12: Mối tương quan giữa khối hvợng phân tử theo hầm số logarií và thể tích rửa giải
Nhận x é t : Đồ thị về mối tương quan giữa logarỉt khối lượng phân tử của các protein và thể tích rửa giải có dạng là một đựỏng thẳng tuyến tính bậc nhất y = ax + b cụ thể là y = - 0.115x + 3,116 (y: logarít khối lượng phân tử của các protein vả x: thể tích rửa giải). Đường thẳng có hệ số tương quan R2 = 0.998 lớn hơn R2 = 0.99. Do đó có thế kết luận trong điều kiện thí nghiệm logMW và Ve tuyến tính nghịch biến. Leptin có MW = 16000Da cóthể tích rửa giải tương ứng ỉà 16,6 ml. Do đó khi tinh chế lựa chọn thể tích thu mẫu từ 15 - 18 ml.