Lắc từng ống nghiệm từ thấp đến cao của dãy nồng độ. Nồng độ thấp nhất mà tại đó không thấy sự phát triển của vi khuẩn (trong như ban đầu) chính là giá trị MIC của kháng sinh trên chủng vi khuẩn đó.
Hình 3.5: Cách xác định giá trị MIC.
Các qui ước phân loại nhạy, nhạy trung gian và kháng xem phụ luc C. Giá trị MBC được xác định là nồng độ thấp nhất không thấy sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường thạch NA.
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát MIC
4.1.1Khảo sát giá trị MIC của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn E. coli
tại mật độ 106 CFU/ml và 105 CFU/ml
* Kết quả khảo sát MIC trên E. coli tại mật độ 106 CFU/ml và 105 CFU/ml.
Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của 20 chủng vi khuẩn E. coli đối với 4 loại kháng sinh: Danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome được trình bày trong Bảng sau:
Bảng 4.1: Kết quả đề kháng của 20 chủng vi khuẩn E. coli. Kháng sinh Số chủng thử 106 CFU/ml 105 CFU/ml
Nhạy Trung bình Kháng Nhạy Trung bình Kháng
Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Dano 20 0 0 0 0 20 100 0 0 0 0 20 100 Doxy 20 0 0 1 5,00 19 95,00 0 0 4 20,00 16 80,00 Cefq 20 17 85,00 1 5,00 2 10,00 17 85,00 2 10,00 1 5,00 Ceft 20 10 50,00 0 0 10 50,00 10 50,00 0 0 10 50,00
Dano (danofloxacin), Doxy (doxycycline), Cefq (cefquinome), Ceft (ceftiofur).
Qua Bảng 4.1: cho thấy tại mật độ 106 CFU/ml vi khuẩn E. coli đề kháng cao với danofloxacin, doxycycline với tỉ lệ là 100% và 95,00% và đề kháng trung bình với ceftiofur là 50,00%. Tỉ lệ vi khuẩn E. coli nhạy cảm cao đối với cefquinome (85,00%) và nhạy trung bình với ceftiofur (50,00%).
Trong số 20 chủng thử nghiệm thì 100% số chủng cho MIC >50 µg/ml đối với danofloxacin và 19/20 chủng cho MIC ≥25 µg/ml đối với doxycycline. Thực trạng này có thể là kết quả của việc sử dụng thường xuyên 2 nhóm kháng sinh này trong điều trị.
Kết quả này có phần cao hơn các nghiên cứu trước đây trên các kháng sinh cùng nhóm. Theo báo cáo của Ngân (2007), tỉ lệ E. coli
đề kháng đối với ciprofloxacin, norfloxacin, tetracycline lần lược là 14,29%, 3,60% và 53,51%, còn trong nghiên cứu của Thảo (2008) thì tỉ lệ E. coli đề kháng với doxycycline là 56,00%. Một nghiên cứu khác của Hạnh (2010), cho thấy E. coli có tỉ lệ đề kháng đối với
ciprofloxacin, norfloxacin, tetracycline là 22,22%, 11,11%, 55,56%. Nguyên nhân sự khác biệt của các kết quả nghiên cứu là do thời điểm nghiên cứu khác nhau, vị trí địa lý, đối tượng lấy mẫu, phương pháp lấy mẫu khác nhau và tình hình diễn biến dịch bệnh.
Tuy nhiên E. coli còn nhạy cảm cao đối với cefquinome (85,00%) và ceftiofur (50,00%). Khảo sát MIC cho thấy trong số 20 chủng thử nghiệm thì có đến 13 chủng cho kết quả nhạy cảm với cefquinome ở mức MIC ≤0,78 µg/ml chiếm tỉ lệ 65,00%, trong đó gồm có 6 chủng nhạy ở mức 0,10 µg/ml, 2 chủng nhạy ở mức 0,20 µg/ml, 3 chủng nhạy ở mức 0,39 µg/ml và 1 chủng nhạy ở mức 0,78 µg/ml. Kết quả này cho thấy tính kháng của E. coli chưa phát triển mạnh đối với cefquinome. Vì cefquinome là kháng sinh mới được sử dụng trong thời gian gần đây, chưa phổ biến nên các chủng kháng thuốc chưa phát triển mạnh đối với kháng sinh này. Tỉ lệ nhạy đối với ceftiofur có phần thấp hơn, điều này được xem là kết quả tất yếu của kháng sinh sau một thời gian lưu hành và sử dụng.
Qua khảo sát MIC tại mật độ 105 CFU/ml cho thấy có sự thay đổi nhỏ tỉ lệ đề kháng đối với doxycycline (từ 95,00% xuống còn 80,00%) và đối với cefquinome là (10,00% xuống còn 5,00%). Bằng phương pháp so sánh Chi quare test tỉ lệ kháng tại mật độ 106 CFU/ml và mật độ 105 CFU/ml cho thấy sự khác biết không có ý nghĩa thống kê (P = 0,934). Kết quả này nói lên rằng không có sự phụ thuộc giữa mật độ vi khuẩn và tỉ lệ kháng. Vì một khi vi khuẩn đã mang gene kháng một thuốc bất kì thì ở mật độ nào vi khuẩn cũng có khả năng đề kháng với thuốc đó.
* Kết quả khảo sát tính đa kháng của vi khuẩn E. coli với các loại kháng sinh.
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của vi khuẩn E.coli.
Kháng sinh bị kháng Số chủng kháng Tỉ lệ (%)
Dano + Doxy 9 45,00
Dano + Doxy + Ceft 8 40,00
Dano + Doxy + Cefq + Ceft 2 10,00
Tổng 19 95,00
Qua Bảng 4.2 cho thấy E. coli có khả năng đề kháng cùng lúc với nhiều kháng sinh. Có 95,00% số chủng đề kháng từ 2 đến 4 loại kháng sinh (19/20). Trong đó có 45,00% đề kháng với 2 loại kháng sinh (9/20), 40,00% đề kháng với 3 loại kháng sinh (8/20) và 10,00% đề kháng với 4 loại kháng sinh (2/20). Kết quả này phù hợp với nhận định của Bùi Thị Tho (2003) cho rằng vi khuẩn
phù hợp với kết quả của Nguyễn Minh Lực (2007) khi có trên 40,00% số chủng kháng từ 3 loại kháng sinh trở lên.
Ngoài ra Bảng 4.2 cho thấy E. coli đề kháng cùng lúc với danofloxacin và doxycyline rất phổ biến (chiếm tỉ lệ 95,00%). Nguyên nhân có thể là do việc sử dụng phổ biến các kháng sinh cùng nhóm như danofloxacin và doxycycline trong điều trị thời gian dài đã tạo nên các chủng đề kháng và việc tiếp nhận các R-plasmid là cơ chế quan trong trọng hình thành nên tính đa kháng trên E. coli.
4.1.2Khảo sát giá trị MIC của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn
Staphylococcus spp. tại mật độ 106CFU/ml và 105 CFU/ml
* Kết quả khảo sát MIC trên Staphylococcus spp. tại mật độ 106
CFU/ml và 105 CFU/ml.
Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của 20 chủng vi khuẩn
Staphylococcus spp. đối với 4 loại kháng sinh: Danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome được trình bày trong Bảng sau:
Bảng 4.3: Kết quả đề kháng của 20 chủng vi khuẩn Staphylococcus spp..
Kháng sinh Số chủng thử
106 CFU/ml 105 CFU/ml
Nhạy Trung bình Kháng Nhạy Trung bình Kháng
Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Dano 20 0 0 2 10,00 18 90,00 1 5,00 6 30,00 13 65,00 Doxy 20 1 5,00 8 40,00 11 55,00 1 5,00 8 40,00 11 55,00 Cefq 20 0 0 8 40,00 12 60,00 3 15,00 5 25,00 10 50,00 Ceft 20 2 10,00 0 0 18 90,00 2 10,00 4 20,00 14 70,00
Từ Bảng 4.3 cho thấy tỉ lệ vi khuẩn Staphylococcus spp. đề kháng với 4 loại kháng sinh luôn ở mức cao (≥55%).
Kết quả khảo sát MIC tại mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml cho thấy Staphylococcus spp. có tỉ lệ đề kháng cao đối với danofloxacin, ceftiofur, cefquinome, doxycyline, tỉ lệ đề kháng lần lược là 90,00%, 90,00%, 60,00% và 55,00%. Kết quả này có phần cao hơn nhiều báo cáo trước đây.
Một số nghiên cứu cho thấy Staphylococcusaureus gây bệnh viêm vú trên bò sữa có tỉ lệ đề kháng với norfloxacin, ciprofloxacin, tetracycline ở mức 4,88%, 7,32%, và 36,59% (Trâm, 2007) và kháng với enprofloxacin, doxycycline, ceftiofur lần lược là 33,33%, 41,87%, 8,38% (Hạnh, 2010).
Sự khác biệt giữa các báo cáo là do tình hình diễn biến dịch bệnh. Hiện nay tụ cầu khuẩn kháng thuốc là vấn đề nang giải bởi các chủng kháng thuốc xuất hiện ngày càng nhiều và tính đa kháng ngày càng mạnh (điển hình là MRSA). Ngoài ra khoảng cách thời gian, vị trí địa lý và đối tượng khảo sát khác nhau đã chi phối đến kết quả.
Trong nghiên cứu này cho thấy khi giảm mật độ vi khuẩn thì tỉ lệ đề kháng có biểu hiện giảm theo nhưng không đồng loạt ở mọi kháng sinh. Tỉ lệ kháng giảm nhiều nhất đối với danofloxacin và ceftiofur từ 90,00% xuống còn 65,00%, và 70,00% (tại 105 CFU/ml). Tỉ lệ kháng giảm nhẹ đối với cefquinome là 10,00% và không đổi đối với doxycycline.
Tỉ lệ đề kháng giảm không đồng nghĩa với tỉ lệ nhạy tăng. Nhưng kết quả Bảng 4.3 cho thấy tỉ lệ nhạy lại tăng lên đối với một số kháng sinh như cefquinome (tăng 15,00%) và danofloxacin (tăng 5,00%).
Bằng phương pháp so sánh Chi quare test tỉ lệ kháng của vi khuẩn
Staphylococcus spp. tại mật độ 106 CFU/ml và 105 CFU/ml cho thấy sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê. Điều này cho phép chúng tôi kết luận tính kháng thuốc không phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn. Bởi một khi vi khuẩn đã mang gene đề kháng với kháng sinh thì tại bất cứ mật độ nào gene đó cũng tồn tại và tính kháng thuốc vẫn được bảo toàn.
Một trong những yếu tố không kiểm soát được như khoảng cách thời gian, khoảng cách địa lý, tình hình diễn biến dịch bệnh, các yếu tố kiểm soát được như đối tượng khảo sát, phương pháp lấy mẫu, kích cở mẫu và phương phát sử lý số liệu đã chi phối trực tiếp đến kết quả nghiên cứu. Nên sự khác nhau giữa các kết quả là hoàn toàn hiển nhiên.
* Kết quả khảo sát tính đa kháng của vi khuẩn Staphylococcus spp. với các loại kháng sinh.
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của vi khuẩn Staphylococcus spp.
Kháng sinh bị kháng Số chủng kháng Tỉ lệ (%)
Dano + Doxy 1 5,00
Dano + Ceft 1 5,00
Cefq + Ceft 2 10,00
Dano + Cefq + Ceft 3 15,00
Dano + Doxy + Ceft 3 15,00
Dano + Doxy + Cefq + Ceft 7 35,00
Tổng 17 85,00
Qua Bảng 4.4 cho thấy Staphylococcus spp. có khả năng đề kháng cùng lúc với nhiều kháng sinh. Trong số 20 chủng thử nghiệm thì có đến 17 chủng đề kháng từ 2 đến 4 loại kháng sinh, chiếm tỉ lệ cao là 85,00%. Trong đó đề kháng với 4 loại kháng sinh là cao nhất lên tới 7 chủng, chiếm tỉ lệ 35,00%. Ngoài ra đề kháng cùng lúc với 2-3 loại kháng sinh củng phổ biến ở mức 20,00 và 30,00%.
Kết quả đa kháng của Staphylococcus spp. cho thấy tính đa kháng của vi khuẩn Gram dương mạnh hơn so với vi khuẩn Gram âm. Phần lớn các chủng
E. coli kháng cùng lúc từ 2 đến 3 loại kháng sinh là chính (chiếm tỉ lệ 75,00%). Trong khi đó tính đa kháng của Staphylococcus spp. thể hiện qua khả năng kháng từ 3 đến 4 cùng lúc (65,00%).
Theo các nhà khoa học, tụ cầu khuẩn có khả năng đề kháng với nhiều kháng sinh cùng lúc là do cơ chế sinh men beta-lactamase trong đó men beta- lactamase phổ rộng có hoạt lực cao và chiếm tỉ lệ lớn (Trần Đỗ Hùng và Trần Thái Ngọc, 2011). Các men này có tác dụng phá hủy cấu trúc vòng beta- lactam làm cho các kháng sinh có cấu trúc beta-lactam mất tác dụng (điển hình là MRSA). Ngoài ra các gene đề kháng khác có thể du nhập dễ dàng qua thể truyền plasmid theo phương thức tiếp hợp.
4.1.3Khảo sát giá trị MIC của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn
Salmonella spp.
* Kết quả khảo sát MIC trên Salmonella spp. tại mật độ 106 CFU/ml và 105 CFU/ml.
Kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của 4 loại kháng sinh: Danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome trên 15 chủng vi khuẩn
Bảng 4.5: Kết quả đề kháng của 15 chủng vi khuẩn Salmonella spp..
Kháng sinh Số chủng thử
106 CFU/ml 105 CFU/ml
Nhạy Trung bình Kháng Nhạy Trung bình Kháng
Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Số chủng Tỉ lệ % Dano 15 0 0 2 13,33 13 86,67 1 6,67 3 20,00 11 73,33 Doxy 15 2 13,33 3 20,00 10 66,67 3 20,00 2 13,33 10 66,67 Cefq 15 5 33,33 5 33,33 5 33,33 9 60,00 4 26,67 2 13,33 Ceft 15 4 26,67 1 6,67 10 66,67 5 33,33 2 13,33 8 53,33
Qua khảo sát MIC tại mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml cho thấy giá trị MIC của 4 loại kháng sinh đối với Salmonella spp. phân bố trong khoảng 0,78 µg/ml đến > 50 µg/ml. Theo kết quả phân loại thu được tỉ lệ số chủng Salmonella spp. đề kháng với danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome lần lược là 86,67%, 66,67%, 66,67% và 33,33%. Tỉ lệ kháng tại mật độ 105 CFU/ml có biểu hiện giảm đối với danofloxacin (từ 86,67% xuống còn 73,33%), ceftiofur (từ 66,67% xuống còn 53,33%) và cefquinome (từ 33,33% xuống còn 13,33%).
Bằng phương pháp so sánh Chi quare test tỉ lệ kháng của Salmonella spp. với kháng sinh tại hai mật độ cho thấy sự khác biệt chưa có ý nghĩa trong thống kê (P = 0,808). Kết quả này cho phép ta kết luận tính kháng thuốc của Salmonella spp. không phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn.
Phân tích Bảng 4.5 cho thấy có sự biến động tỉ lệ nhạy giửa hai mật độ, từ 0% tăng lên 6,67% đối với danofloxacin, từ 33,33% tăng lên 60,00% đối với cefquinome, từ 26,67% tăng lên 33,33% đối với ceftiofur và từ 13,33% tăng lên 20,00% đối với doxycycline. Và hầu như giá trị MIC chỉ giao động trong khoảng nồng độ kế kận. Điều này có thể lý giải là sự suy yếu của vi khuẩn sau mỗi lần cấy chuyển.
Ngoài ra tỉ lệ kháng kháng sinh tại mật độ 106 CFU/ml cho thấy
Salmonella đề kháng cao với các kháng sinh thử nghiệm. Tỉ lệ kháng đặc biệt cao với danofloxacin doxycycline, ceftiofur và đề kháng trung bình với cefquinome. Tính đề kháng mạnh đối với danofloxacin khi có đến 12 chủng kháng ở mức > 50 µg/ml, chiếm 80,00%. Mức đề kháng cao đối với danofloxacin có thể là do Salmonella đã hình thành cơ chế kháng nhóm flouroquinolone thông qua việc sử dụng phổ biến các kháng sinh trong nhóm flouroquinolone.
Theo một số báo cáo gần đây cho thấy các kháng sinh cùng nhóm flouroquinolone và tetracycline đang bị đề kháng mạnh. Cụ thể là tỉ lệ
Salmonella spp. đề kháng với oxytetracycline là 45,00% [33], kháng tetracycline là 75,00% [34], kháng ofloxacin là 83,30% [33], kháng norfloxacin là 50,00% [34]. Tuy chưa có các báo cáo tiến hành trong nước về tình hình đề kháng với các kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, 4 nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy sự xuất hiện phổ biến các gene sinh men beta-lactamase trong đó có cephalosporinase là nguyên nhân chính khiến các kháng sinh cephalosporin mất tác dụng.
* Kết quả khảo sát tính đa kháng của vi khuẩn Salmonella spp. với các loại kháng sinh.
Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của vi khuẩn Salmonella spp.
Kháng sinh bị kháng Số chủng kháng Tỉ lệ (%)
Doxy + Ceq 1 6,67
Dano+ Doxy 1 6,67
Dano + Ceti 3 20,00
Dano + Doxy + Ceq 1 6,67
Dano + Doxy + Ceti 4 26,67
Dano + Ceq + Ceti 1 6,67
Dano + Doxy + Ceq + Ceti 2 13,33
Tổng 13 86,67
Qua Bảng 4.6 cho thấy Salmonella spp. có khả năng đề kháng cùng lúc với nhiều kháng sinh. Có 86,67% số chủng đề kháng từ 2 đến 4 loại kháng sinh. Trong đó đề kháng cùng lúc với 2, 3 loại kháng sinh là chính (11 trong 15 chủng, chiếm tỉ lệ 73,34%). Tỉ lệ vi khuẩn kháng 4 loại kháng sinh cùng lúc thấp (2 chủng chiếm 13,33%).
So sánh với kết quả đa kháng trên vi khuẩn E. coli ta thấy có sự giống nhau về tính đa kháng của trực khuẩn Gram âm. Kết quả này phù hợp với nhận định của Bùi Thị Tho (2003) khi cho rằng trực khuẩn Gram âm có thể
kháng từ 3 loại kháng sinh trở lên là chính. Ngoài ra theo nghiên cứu của Lực (2007) cho thấy có đến 30,00% số chủng Salmonella spp. kháng cùng lúc với 3 loại kháng sinh.
Ngoài ra Bảng 4.6 cho thấy đa số chủng điều có khả năng đề kháng cùng lúc với danofloxacin và doxycyline. Điều này cho thấy việc sử dụng kháng sinh thường xuyên, phổ biến và trong thời gian dài đã tác động mạnh đến tình hình đề kháng. Vì flouroquinolone và tetracycline là hai nhóm kháng sinh được sử dụng từ lâu và rất phổ biến trong chăn nuôi thú y nên khả năng bị đề kháng và đa kháng cùng lúc là điều hiển nhiên.
Tính đa kháng phổ biến trên họ trực khuẩn Gram âm trong đó có vi khuẩn Salmonella spp.. Nguyên nhân chính là do chúng dễ dàng thu nhận các R-plasmid từ các cá thể cùng loài hoặc khác loài, sự thu nhận các R-plasmid được tích lũy theo thời gian và hình thành nên tính đa kháng.
4.1.4 Khảo sát giá trị MIC của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn
Klebsiella spp.
Kết quả khảo sát MIC trên Klebsiella spp. tại mật độ 106 CFU/ml và 105 CFU/ml.
Khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh của 15 chủng vi khuẩn Klebsiella