Sự lây truyền dịch bệnh trên vật nuôi sang người ngày càng nguy hiểm. Gần đây một số trường hợp vi khuẩn kháng thuốc trên người được xem là có nguồn gốc từ động vật, nguyên nhân bắt nguồn từ việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi.
Tuy chưa có các số liệu công bố về tình hình gây bệnh của vi khuẩn kháng thuốc trong chăn nuôi gây bệnh trên người. Nhưng khả năng đề kháng tiếp nhận giữa các chủng là rất cao. Chính vì vậy mà việc giám sát tình hình dịch tể, khả năng đề kháng trong chăn nuôi thú y cũng gớp phần quan trọng trong công tác bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Theo nhiều nghiên cứu cho thấy trong số các bệnh do vi khuẩn gây ra thì
E. coli, Staphylococcus, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas là thường gặp nhất [13, 17]. E. coli, Staphylococcus, Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas có khả năng gây bệnh trên người và vật nuôi. Tỉ lệ nhiễm khuẩn từ vật nuôi sang người là rất cao, chủ yếu theo đường ăn uống không nấu chín, thực phẩm không hợp vệ sinh, …
2.4.1.1 Staphylococcus spp.
Đặc điểm hình thái: Là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình cầu, đường kính 0,8-1,0 µm, sống tụ tập như chùm nho.
Hình 2.7: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử. (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Staphylococcus_aureus_01.jpg)
Đặc điểm nuôi cấy: Tụ cầu khuẩn sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, dễ mọc trong các môi trường nuôi cấy (32 oC-37 oC, pH từ 7,2-7,6). Trong môi trường nước thịt sau 12-24 h, nước thịt bị đục, có màng [18]. Trong môi trường thạch sau 12-24 h, khuẩn lạc tròn, đường kính 2-4 mm, màu trắng, vàng, vàng chanh, hơi ước. [19].
Hình 2.8: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường thạch NA. Đặc tính gây bệnh: Là vi khuẩn gây bệnh trên người và động vật, sinh mủ điển hình làm cho các tổ chức cơ thể sưng gây viêm mủ, một số trường hợp chuyển sang huyết nhiễm mủ và bại huyết [19]. Một số chủng có khả năng gây tiêu huyết, làm đông đặc huyết tương, và độc tố (thường thấy trong các vụ độc thực phẩm).
Khả năng đề kháng: Hiện nay đang đề kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau và đang là vấn đề khó khăn trong điều trị [20]. Một số chủng đã có khả năng đề kháng kháng sinh beta-lactam như nafcillin, methicillin [21].
2.4.1.2 Escherichiacoli
Đặc điểm hình thái: Là trực khuẩn hình gậy ngắn, có tiêm mao, kích thước 2×0,6 µm. Đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, không có khả năng hình thành nha bào [19]. Là vi khuẩn Gram âm sống trong đường ruột người và các loài động vật khác.
Hình 2.9: Vi khuẩn E. coli dưới kính hiển vi điện tử.
(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:EscherichiaColi_NIAID.jpg) Đặc điểm nuôi cấy: Là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi. Thuận lợi phát triển trong nhiều môi trường nuôi cấy. Một số hóa chất như chlorine, muối
mật có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Phát triển tốt trong môi trường nước thịt, hình thành cặn và đôi khi hình thành màng xám nhạt. Trong môi trường thạch, khuẩn lạc màu trắng nhạt, tròn ướt, hơi lồi, đường kính 2-3 mm.
Hình 2.10: Khuẩn lạc E. coli trên môi trường thạch NA.
Đặc tính gây bệnh: E. coli thường tiết ra các nội độc tố và ngoại độc tố. Nội độc tố gây ra bệnh tiêu chảy, ngoại độc tố gây tan huyết và phù thủng.
Khả năng đề kháng: Hiện E. coli đang đề kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Theo một vài báo cáo gần đây, 12% E. coli kháng với 7 loại kháng sinh, 32% kháng với 6 loại kháng sinh, 40% kháng với 5 loại kháng sinh, 10 kháng với 4 loại kháng sinh, 6% kháng với 3 loại kháng sinh [22]. Khả năng đề kháng với ampicillin, chloramphenicol, gentamicin, kanamycin, streptomycin, tetracycline, trimethoprim là 86%, 13,5%, 1,1%, 2,3%, 80,3%, 47,2%, 65,7% [23].
2.4.1.2 Pseudomonas spp.
Đặc điểm hình thái: Pseudomonas spp. là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, không sinh nha bào di động nhờ roi ở đầu. Một số chủng được biết như một tác nhân xử lý ô nhiễm môi trường. Một số chủng có thể gây hư hỏng thức ăn. Một số chủng P. aeruginosa, P. oryzihabitans, và P. plecoglossicida, P. aeruginosa có trong môi trường bệnh viên, là những nguyên nhân gây nhiễm trùng phổ biến nhất (nhiễm trùng bệnh viện).
Đặc điểm nuôi cấy: Là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi. Sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 37 oC. Trong môi trường thạch, khuẩn lạc tròn, bóng, trong suốt. Trong môi trường nước thịt, xuất hiện màng xanh.
Hình 2.11: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi điện tử. (Nguồn:
http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/File:P.aerugenosa_scanning_3.jpg)
Hình 2.12: Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi trường thạch NA. (Nguồn:
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Pseudomonas_fluorescens_on_TY_agar_%2 8white_light%29.JPG)
Đặc tính gây bệnh: Các chủng Pseudomonas gây bệnh có thể phát triển ở hầu hết các bộ phận của cở thể sinh vật gây ra bệnh viêm phổi và các bệnh nhiểm trùng bao gồm máu, tim, xương, khớp, phổi, hệ thống thần kinh, mắt, tai, đường tiết niệu, da và mô mềm với nước mũ màu xanh. Bệnh thường diển biến ở các cơ thể có hệ miễn dịch suy yếu, tỉ lệ tử vong do nhiểm trùng bởi
Pseudomonas thường cao [24].
Khả năng đề kháng: Pseudomonas có khả năng đề kháng với nhiều kháng sinh, bao gồm penicillin, ampicillin, tetracyclin, cephalosporin thế hệ 1 và 2, sulfonamides, neomycin, streptomycin, kanamycin, chloramphenicol, nitrofuran, và trimethoprim-sulfonamide. Chỉ có một số kháng sinh beta-lactam phổ rộng như imipenem, carbapenem, các fluoroquinolones, amikacin, gentamicin, các cephalosporin thế hệ 4 như cefepime mới có khả năng điều trị [25].
2.1.1.2 Salmonella spp.
Đặc điểm hình thái: Là vi khuẩn Gram âm thuộc họ trực khuẩn đường ruột, hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4-0,6×1-3 µm, không có khả năng hình thành giáp mô và nha bào, có khả năng di động nhờ chiêm mao.
Hình 2.13: Vi khuẩn Salmonella typhimurium dưới kính hiển vi điện tử. (Nguồn: http://textbookofbacteriology.net/salmonella_2.html) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đặc điểm nuôi cấy: Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí vừa kỵ khí tùy tiện, phát triển tốt trong môi trường thạch thường với nhiệt độ thích hợp là 35- 37 oC, sau 20-24 h hình thành khuẩn lạc tròn, trong suốt hoặc hơi đục. Trong môi trường nước thịt sau 18 h môi trường chuyễn sang đục. Nuôi lâu xuất hiện cặn dưới đáy ống nghiệm, phía trên có màng mỏng [18].
Hình 2.14: Khuẩn lạc Salmonella typhimurium trên môi trường thạch TSA. (Nguồn: http://academic.pgcc.edu/~kroberts/web/colony/styphi.gif) Đặc tính gây bệnh: Salmonella spp. có khả năng sinh nội độc tố và ngoại độc tố. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể thông qua đường ăn uống là chính, khi vào đến ruột non, vi khuẩn chui qua niêm mạc ruột để xâm lấn tới các hạch bạch huyết, sinh trưởng và phát triển tại đó. Một số vi khuẩn có khả năng tự li
giải, phóng thích ra các nội độc tố, nội độc tố gây độc thần kinh, hôn mê, co giật, gây xung huyết và mụn loét, một số vi khuẩn xâm nhập vào hệ bạch huyết và hệ tuần hoàn máu gây nhiễm trùng huyết. Ngoại độc tố tác động vào hệ tiêu hóa gây tiêu chảy [18]. Một số chủng S. typhimurium, S. enteritidis không chỉ gây bệnh trên vật nuôi mà còn có khả năng gây bệnh trên người, là những nguyên nhân gây nên các vụ ngộ độc thực phẩm [26].
Khả năng đề kháng: Có 37,40-68,10% số chủng vi khuẩn kháng lại chloramphenicol, 33,40-59,60% kháng lại tetracycline, 74,60-89,24% kháng lại streptomycin. Những kháng sinh dùng nhiều và phổ biến có tỉ lệ kháng cao như streptomycin, sulfonamide [22].
2.1.1.2 Klebsiella spp.
Đặc điểm hình thái: Là trực khuẩn Gram âm, hình gậy nhắn, sống kị khí tuỳ nghi, không có khả năng di động, có lớp vỏ polysaccharide đặc trưng và không có khả năng sinh nha bào.
Hình 2.15: Vi khuẩn Klebsiella spp. dưới kính hiển vi điện tử.
Đặc điểm nuôi cấy: Vi khuẩn dễ mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường. Trên thạch dinh dưỡng hay thạch máu xuất hiện khuẩn lạc nhầy, màu xám. Trong môi trường canh thang, xuất hiện cặn dưới đáy.
Đặc tính gây bệnh: Klebsiella spp. có mặc khắp nơi trong tự nhiên như đất, nước thải, các sản phẩm thực vật, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao. Ở người có thể tìm thấy Klebsiella spp. ở da, cổ họng, đường ruột, nước tiểu, hoặc vết thương. Các chủng Klebsiella gây ra nhiều chứng bệnh đặc nhiêm trọng như viêm phổi, viêm màng phổi, apxe phổi, nhiễm trùng đường tiểu, nhiễm trùng huyết, viêm cứng đốt sống, viêm màng não và viêm mô mềm [27]. Klebsiella là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện nhiều nhất hiện nay.
Khả năng đề kháng: Hiện tại tính đề kháng của Klebsiella là rất cao. Hầu hết đã đề kháng với ampicillin do sự hiện diện của gene mã hoá beta-lactamase đặc hiệu với penicillin. Một số chủng còn có khả năng tiết ra men beta- lactamase phổ rộng hay còn gọi là ESBL (extended spectrum beta-lactamase) đề kháng các kháng sinh phổ rộng thế hệ mới như cephalosporin thế hệ 3, thế hệ 4 và nhiều kháng sinh khác như aminoglycoside, fluoroquinolone. Cơ chế sinh kháng ESBL được xác định là thu nhận từ plasmid [27].
2.1.2Kháng sinh 2.4.2.1 Danofloxacin
Công thức cấu tạo: C19H20FN3O3
N F O OH O N N
Khối lượng phân tử: 357,37 g/mol.
Dạng tinh thể màu trắng. Tan tốt trong nước và có độ ổn định cao trong môi trường acid lẫn base.
Danofloxacin là kháng sinh tổng hợp thuộc nhóm fluoroquinolone có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Danofloxacin được sử dụng trong việc điều trị các bệnh đường hô hấp ở gà, trâu, bò và lợn.
Danofloxacin hấp thu tốt thông qua đường uống và được dùng cho tiêm dưới da hoặc tiêm bắp. Thời gian bán thải phụ thuộc vào từng loài, đào thải chủ yếu theo nước tiểu và phân.
2.4.2.2 Doxycycline
Công thức cấu tạo: C22H24N2O8.
O OH OH O O OH H2N OH H OHH N
Khối lượng phân tử: 444,43g/mol.
Doxycycline thuộc dẫn chất nhóm tetracycline, có phổ kháng khuẩn rộng, được chỉ định dùng trên người và động vật. Thuốc hấp thu tốt thông qua đường uống (95 %) và dạng bột dùng để tiêm tĩnh mạch. Là thuốc ít gây độc trên gan nhất trong họ tetracycline.
Giống như các tetracycline khác, doxycycline có tác dụng kiềm khuẩn do ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn khi gắn vào vị trí 30S thậm chí là trên 50S của ribosome bởi khả năng tạo phức với các ion Mg2+, thuốc có thể làm thay đổi màng bào tương. Hiệu quả ức chế trên vi khuẩn hiếu khí và kị khí, Gram âm lẫn Gram dương như Rickettsia, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Legionella spp., Ureaplasma, một số Mycobacterium không điển hình và Plasmodium spp. Vi khuẩn kháng với một thuốc thuộc nhóm tetracycline thì cũng có khả năng kháng với các thuốc thuộc tetracyclin khác.
2.4.2.3 Ceftiofur
Công thức cấu tạo: C19H17N5O7S3
N S S O HO HN N O S N O O O H2N O H
Khối lượng phân tử: 523,56 g/mol.
Là kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ 3, được chỉ định điều trị trên gia súc gia cầm. Có phổ kháng khuẩn rộng trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương
Với cấu trúc 2-aminothiazol làm mở rộng phổ kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram âm, tăng cường hoạt lực diệt khuẩn.
Nhóm methoxyimino có tác dụng tăng tính bền với men lactamase. Trong khi cấu trúc furanylcarbonylthiomethy làm tăng cường khả năng diệt khuẩn và kéo dài tác động. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
N S S O HO HN N O S N O O O H2N O H Nhóm furanylcarbonylthiomethyl Nhóm 2-aminothiazol Nhóm methoxylmino
Hình 2.17: Đặc điểm cấu trúc phân tử ceftiofur.
Ceftiofur được cho là có khả năng tiêu diệt trên các chủng có sinh men beta-lactamase. 2.4.2.4 Cefquinome Công thức phân tử: C23H24N6O5S2. N S N HO N O S N O O H2N O H
Khối lượng phân tử: 528,60 g/mol.
Cefquinome là một kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin thế hệ thứ tư.
N S N HO HN N O S N O O H2N O H Nhóm 2-aminothiazol Nhóm methoxylmino quatermary ammonium zwitter-ionic
Hình 2.18: Đặc điểm cấu trúc phân tử cefquinome.
Với cấu trúc zwitterionic, có thể thẩm thấu nhanh qua màng sinh học, bao gồm cả màng porins của tế bào vi khuẩn. Thêm vào đó, nó có ái lực thấp với beta-lactamase và ái lực cao hơn trong việc gắn kết trên các protein của vi khuẩn tương tự penicillin. Với cấu trúc chính là khung sườn beta-lactam, trong khi các nhóm chức ngoại vi chính là một quinolinium bậc bốn, một phân nữa aminothiazolyl và nhóm thế O-alkyl oxime làm tăng hoạt tính trên vi khuẩn Gram âm.
Cefquinome là kháng sinh dùng trong thú y với phổ kháng khuẩn rộng trên cả vi khuẩn Gram dương lẫn Gram âm, có hoạt tính tốt trên cầu khuẩn S. pneumoniae đề kháng penicillin G, các Enterobacteriaceae bao gồm các chủng tiết beta-lactamase. Hoạt tính tốt trên Pseudomonas aeruginosae. Cơ chế tác động được biết là ức chế sự tổng hợp thành tế bào,
Cefquinome được dùng ở dạng tiêm, chỉ định trên các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, viêm phổi, và các bệnh nhiễm trùng do E.coli, Streptococcus suis.
CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1Hóa chất
Môi trường Nutrient Broth (NB), Merck. Môi trường Nutrient Agar (NA), Merck. Kháng sinh bột.
NaCl, Merck. Nước RO.
3.1.2Thiết bị và dụng cụ
Tủ ấm 37 oC Bể điều nhiệt
Hình 3.1: Một số thiết bị dùng trong thử nghiệm MIC. Buồn cấy. Autoclave. Tủ lạnh. Cân phân tích. Đèn cồn.
Que cấy vi khuẩn. Máy trộn Vortex.
Độ đục chuẩn (McFarland, Remel)
Auto pipét 100 µl, 1.000 µl, 10.000 µml và đầu col các loại. Ống nghiệm 10 ml có nắp vặn.
Autoclave Buồn cấy
Đĩa petri 90×15 mm.
Cốc thủy tinh 1000 ml, ống đông có vạch chia, đủa thủy tinh, lọ hấp môi trường.
3.1.3Vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn gây bệnh được phân lập từ những mẫu bệnh phẩm trên gia súc gia cầm do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Vemedim cung cấp. Có tất cả 81 chủng được dùng trong thử nghiệm này, gồm có:
E. coli: 20 chủng
Staphylococcus spp.: 20 chủng. Salmonella spp.: 15 chủng. Kebesilla spp.: 15 chủng. Pseudomonas spp.: 11 chủng.
Và 4 chủng chuẩn: Staphylococcus aureus ATCCR 25923TM, Salmonella enterica ATCCR 13311TM, E. coli ATCCR 9637TM, Pseudomonas ATCCR
51821TM. Tất cả được bảo quản lạnh và lưu giữ tại phòng Vi sinh thuộc Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Vemedim–Công ty cổ phần SXKD vật tư thuốc thú y Vemedim.
3.2 Địa điểm tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đề tài được tiến hành tại phòng Vi sinh thuộc Trung tâm nghiên cứu và phát triển sản phẩm–Công ty cổ phần SXKD vật tư thuốc thú y Vemedim. Địa chỉ: 07 Đại lộ 30/4, Phường Xuân Khánh, Quận Ninh Kiều, T.P Cần Thơ.
Thời gian từ tháng 8/2013 đến 11/2013.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
Qui trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sử dụng phương pháp pha loãng kháng sinh trong môi trường lỏng được tuân thủ theo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012).
Tiêu chuẩn chích dẫn: Dựa trên tiêu chuẩn của CLSI, 2012.
3.3.1Phương pháp pha huyền dịch vi khuẩn
Cấy chuyển vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn trước khi thử nghiệm được cấy chuyển sang môi trường thạch NA và được ủ ấm (37 oC) trong vòng 18-24 h để thu khuẩn lạc.
Chuẩn độ vi khuẩn: Dùng que cấy lấy một lượng nhỏ khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 9 ml NaCl 0,85% (đã pha và hấp tiệt trùng ở 121 oC/15
phút). Khuấy trên máy trộn Vortex để đồng nhất. Huyền dịch vi khuẩn được đặt trước thẻ Wickerham 1 cm cùng với Mac Farland 0,5. Điều chỉnh độ đục vi khuẩn bằng cách thêm nước muối hoặc khuẩn lạc sao cho hình ảnh sau dung dịch vi khuẩn tương đồng với hình ảnh sau Mac Farland 0,5 (tương đương 108 CFU/ml).
Hình 3.2: Cách chuẩn độ đục với Mac Farland trên thẻ Wickerham. Pha huyền dịch vi khuẩn 106 CFU/ml: Dùng auto pipet hút 500 µl huyền dịch vi khuẩn 108 CFU/ml cho 49,5 ml nước thịt (đã hấp tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút), khuấy trên máy trộn Vortex, thu được dung dịch vi khuẩn 106
CFU/ml.
Pha huyền dịch vi khuẩn 105 CFU/ml: Dùng auto pipet hút lấy 1ml huyền dịch vi khuẩn 108 CFU/ml cho vào ống nước thịt 9 ml (đã hấp tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút), khuấy trên máy trộn Volte để thu được mật độ 107
CFU/ml. Tiếp tục hút 500 µl huyền dịch 107 CFU/ml cho vào 49,5 ml nước