Từ cặn chiết etyl axetat (BS-Et) và cặn chiết nước (BS-W) thân rễ cây xạ can chúng tôi đã phân lập được 14 hợp chất ký hiệu từ BS-1 đến BS-14 (theo sơ đồ
phân lập hình 3.4 và hình 3.5), cấu trúc của các hợp chất đã được xác định bằng cách kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại như sau:
Hợp chất BS-1 (15)
Chất BS-1 phân lập được ở dạng bột mầu vàng từ cặn chiết etyl axetat của thân rễ cây Xạ can. Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR (Hình 4.17a) của chất BS-1 xuất hiện 4 proton thơm tại δ6,56 (1H, s, H-8); 7,77 (1H, s, H-2) và δ 6,67 (2H, s, H-2', H-6'), sự có mặt của một nhóm dioxymethylene được xác định bởi tín hiệu singlet tại δ5,99 (2H, s, O-CH2-O) và bốn tín hiệu singlet của 4 nhóm methoxy gắn vào vòng thơm tại δ 4,00 (3H, s, OCH3-5); 3,81 (6H, s, OCH3-3', 5') và 3,77 (3H, s, OCH3-4'). Tương tác giữa proton tại δ 7,76 (H-2) với cacbon tại δ 150,8 (C-2) trong phổ HSQC xác định tương tác giữa H-2/C-2 của vòng isoflavon trong phân tử chất
BS-1. Ngoài ra còn tín hiệu tương tác của proton tại δ 6,67 với các bon tại δ 106,6 và 2 nhóm metoxy tại δ 3,81/δ 56,0 cho thấy vòng B bị thế tại bốn vị trí và hai nhóm metoxy gắn vào C-3′ và C-5′ [105].
Phổ13C-NMR và DEPT (Hình 4.17b) của BS-1 chỉ ra tín hiệu của 20 nguyên tử các bon gồm 4 nhóm methoxyl (δ 56,0x2; 60,9; và 60,6), 1 nhóm dioxymethylen (δ 102,1) và 15 nguyên tử cacbon thuộc về khung isoflavone. Trên phổ HMBC (Hình 4.3d) xuất hiện các tương tác xa giữa proton H-2 (δ 7,76) với cacbon C-4 (δ
175,3), C-9 (δ154,5) và C-1′ (δ127,3); giữa proton H-8 (δ 6,56) với C-9 (δ154,5), C-7 (δ152,9), C-6 (δ135,2) và C-10 (δ 113,4); và giữa proton dioxymethylene tại δ
5,99 với C-6 (δ 135,2) và C-7 (δ 152,9), điều này xác nhận sự có mặt của khung isoflavon và nhóm thế dioxymethylene gắn vào vị trí C-6 và C-7.
Hình 4.17b Phổ DEPT của chất BS-1
Dữ liệu phổ HMBC cho thấy proton H-2′ tại δH 6,67 lại tương tác với C-3 (δ
125,4), C-3′ (δ 152,8) và C-4′ (δ 137,9), proton methoxyl tại δ 3,81 và 3,77 có tương tác với C-3′ (δ 152,8) và C-4′ (δ 137,9), điều này cho thấy 3 nhóm methoxyl
được gắn vào C-3′, C-4′ và C-5′.
Từ các dữ liệu đã phân tích ở trên cấu trúc của chất BS-1được chỉ ra như hình 4.17e với công thức phân tử là C20H18O8, với pic ion phân tử [M-H]¯ tại m/z 385 trong phổ ESI (Hình 4.17d). So sánh với tài liệu tham khảo [151], hợp chất BS-1
được xác định là 5,3′,4′,5′-tetramethoxy-6,7-methylenedioxyisoflavone hay irisflorentin (hình 4.17e). Hình 4.17d Phổ khối lượng ESI-MS của chất BS-1 O O O O OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 1' 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2' 3' 4' 5' 6' Hình 4.17e Cấu trúc của hợp chất BS-1 (irisflorentin) Hợp chất BS-2 (16) và BS-3 (17)
Chất BS-2 phân lập được dạng tinh thể màu vàng nhạt, điểm chảy 235-236°C. Sự có mặt của khung isoflavon trong phân tử chất BS-2được dựđoán qua phổ hấp thụ tử ngoại UV tại λmax 259, 320nm. Phổ1H-NMR (Hình 4.18a) của BS-2 chỉ ra sự
có mặt một singlet tại δ 7,99 (1H, s) là của proton H-2, các tín hiệu singlet khác tại
δ 6,41 (1H, s) dự đoán vòng A là penta-substituted và một nhóm methoxyl tại δ
H-3′, 5′) và 7,35 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz, H-2′, 6′) dự đoán nhóm thế của vòng thơm là para-substitued,
Hình 4.18a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-2
Phổ 13C-NMR (Hình 4.18b) của BS-2 chỉ ra tín hiệu của 16 nguyên tử cacbon, gồm một nhóm methoxyl và 15 cac bon của khung isoflavone, các tín hiệu này đã
được xác nhận thêm qua phổ DEPT 90, DEPT 135 và HSQC. Thêm vào đó, trên phổ ESI MS (Hình 4.18c) pic ion phân tử [M-H]+ của BS-2 xuất hiện tại m/z 299 hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử C16H12O6.
Hình 4.18c Phổ khối lượng ESI-MS của chất BS-2
Khi so sánh với tài liệu tham khảo [113], tất cả dữ liệu phổ của chất BS-2đồng nhất với các dữ liệu phổ của 4′,5,7-trihydroxy-6-methoxyisoflavone hay tectorigenin vì vậy chất BS-2được xác định là tectorigenin.
O O OH HO MeO OH 1' 4' 2' 3' 5' 6' 3 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 4.18d Cấu trúc của hợp chất BS-2 (Tectorigenin)
Chất BS-3 phân lập được dạng tinh thể màu vàng. Phổ UV, 1H- và 13C-NMR của BS-3 tương tự như của chất BS-2 cho thấy chất BS-3 cũng là một isoflavonoid. Trên phổ 1H-NMR (Hình 4.19a) của BS-3 cho các tín hiệu proton tại δ 6,88 (1H, d,
J = 8,0 Hz, H-2′), 6,96 (1H, dd, J = 8,0; 2,0 Hz, H-6′), và 7,14 (1H, J = 2,0 Hz, H- 5′) cho thấy vòng B bị thế tại vị trí 1, 3, 4 tín hiệu của 2 singlet tại δ 6,46 và 8,06
được gán lần lượt cho proton H-8 và H-2, hai nhóm methoxyl xuất hiện tại δ 3,89 (3H, s, OCH3-6) và 3,90 (3H, s, OCH3-3′).
Hình 4.19a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-3
Phổ13C-NMR của BS-3 xuất hiện tín hiệu của 17 nguyên tử cácbon bao gồm hai nhóm methoxyl tại δ 56,4 (OCH3-3′) và 60,9 (OCH3-6), còn lại các nguyên tử
khác thuộc về khung isoflavone, điều này cũng được xác nhận trên phổ DEPT 90, DEPT 135, HSQC và HMBC. Hơn nữa, phổ khối ESI MS của BS-3 chỉ ra pic ion [M-H]+ tại m/z 329 phù hợp với công thức phân tử C17H14O7.
Hình 4.19b Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của chất BS-3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, chất BS-3 được xác định là iristectorigenin A hay (4′,5,7-trihydroxy-3′,6 dimethoxyisoflavone) [113].
O O OH HO H3CO OCH3 OH Hình 4.19c Cấu trúc của hợp chất BS-3 (iristectorigenin A)
Hợp chất BS-4 (18)
Phổ13C-NMR (Hình 4.20b) của chất BS-4 tương tự như chất BS-3 ngoại trừ có xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm methoxy do vậy chất BS-4 cũng được dự đoán là dẫn xuất của chất BS-3.
Hình 4.20a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-4
Tín hiệu proton và các bon của 3 nhóm methoxy tại δ 3,88/136,2; 3,89/152,7 và 3,94/131,2; bốn cacbon metin tại δ 7,90/153,3; 6,48/93,9; 6,68/105,7 và δ
6,68/109,4 được xác nhận từ phổ13C-NMR, DEPT 90, DEPT 135 và HSQC. Vị trí của các nhóm thế methoxy tại C-6, C-5′ và C-4′được xác định qua phổ tương tác xa HMBC.
Cấu trúc của chất BS-4được chỉ ra ở hình 4.20c, các dữ liệu phổ cộng hưởng từ
của BS-4 hoàn toàn phù hợp với dữ liệu phổ của 3′,5,7-trihydroxy-4′,5′,6 trimethoxyisoflavone (hay irigenin) khi so sánh với tài liệu tham khảo [113]. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với phổ khối ESI MS của BS-4 với pic ion phân tử [M- H]- tại m/z 359, phù hợp với công thức phân tử là C18H16O8. Do vậy, chất BS-4 được xác định là irigenin. O H3CO O HO OH OCH3 OH OCH3 1' 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2' 3' 4' 5' 6' Hình 4.20c Cấu trúc của hợp chất BS-4 (irigenin) Hợp chất BS-5 (19) Phổ 13C-NMR (Hình 4.21a) của BS-5 xuất hiện tín hiệu của 9 nguyên tử các bon. Trong đó có 6 tín hiệu của các bon vòng thơm tại δ130,3 (C-2); 124,1 (C-3); 146,6 (C-4); 150,4 (C-5); 113,8 (C-6) và 109,8 (C-7), 3 tín hiệu khác tại δ 196,7; 26,17 và 56,12 lần lượt của nhóm cacbonyl, methyl, và methoxyl.
Tín hiệu tại δ 6,94 (d, J = 8,0 Hz); 7,54 (dd, J = 8,0; 1;8 Hz), và 7,53 (d, J =
1,8 Hz) trong phổ1H-NMR (Hình 4.21b) xác nhận vòng thơm bị thế tại vị trí 1, 3, 4.
Hình 4.21b Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-5
Trên phổ HMBC xuất hiện các tương tác giữa H-8 (δ 2,56) và C-2 (δ 130,3), giữa H-6 (δ 6,94) và C-4 (δ 146,6), giữa H-7 (δ 7,54) và C-5 (δ 150,4), và giữa proton methoxyl tại δ 3,96 và C-4 và không xuất hiện tương tác giữa H-7 và C-4.
Điều này xác nhận rằng nhóm hydroxyl, methoxy và cacbonyl lần lượt gắn vào các vị trí C-5, C-4 và C-2 của vòng thơm.
Phổ ESI MS của BS-5 xuất hiện píc ion phân tử [M+H]+ tại m/z 167 hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử C9H10O3 .
Hình 4.21d Phổ khối lượng ESI-MS của chất BS-5
Từ các dữ liệu trên cho phép xác định chất BS-5 là acetovanillone. Hợp chất này lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can.
CH3 O OCH3 OH 1 2 3 4 5 6 Hình 4.21e Cấu trúc của hợp chất BS-5 (acetovanillone) Hợp chất BS-6 (20)
Hợp chất BS-6 nhận được ở dạng tinh thể màu vàng. Phổ tử ngoại UV-VIS
của nó cho đỉnh hấp thụ tại λmax 255 nm (dải I) và 365 nm (dải II) đặc trưng cho sự
có mặt của khung flavonoit trong phân tử. Phổ 1H-NMR (Hình 4.22a) của BS-6
xuất hiện hai duplet tại δ 6,93 (2H, J = 8,5 Hz, H-3, 5′) và 7,82 (2H, J = 9,0 Hz, H- 2′, 6′) cho thấy vòng C bị thế tại para-, ngoài ra còn có hai singlet tại δ 6,54 (H-8) và 6,56 (H-6) cùng với một singlet của nhóm methoxy tại 3,89 (OCH3-7).
Hình 4.22a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-6
Phổ 13C-NMR và DEPT 90, DEPT 135 của BS-6 chỉ ra tín hiệu của 16 cacbon gồm: 1xCH3 (δ 60,9); 6xCH và 9xCq trong đó tín hiệu của nhóm C=O (C-4) tại δ 182,4; điều này được khẳng định thêm bởi các dữ liệu từ phổ HSQC. Phổ khối ion hóa bụi electron (ESI-MS) của BS-6 cho píc ion tại m/z 299 [M-H]+ tương ứng với công thức phân tử C16H12O6. So sánh dữ liệu phổ của chất BS-6 với các dữ liệu
đã được công bố [59] là hoàn toàn phù hợp, do vậy chất BS-6 được xác định là rhamnocitrin hay 3, 4′, 5-trihydroxy-7-methoxyflavone.
O OH OH H3CO OH O 2 4 5 7 3' 4' 1' 5' 6' 6 8 3 9 10 2' Hình 4.22b Cấu trúc của hợp chất BS-6 (rhamnocitrin) Hợp chất BS-7 (21)
Hợp chất BS-7 phân lập được ở dạng bột màu vàng. Phổ tử ngoại UV-VIS
của nó cho đỉnh hấp thụ tại λmax 259 và 320nm gợi ý cho sự có mặt của khung isoflavonoit trong phân tử. Phổ khối ion hóa bụi electron (ESI-MS) (Hình 4.23c) với píc ion tại m/z 315 [M-H]- tương ứng với công thức phân tử C16H12O7 (M=316)
Phổ 1H-NMR (Hình 4.23a) của chất BS-7 cho các tín hiệu cộng hưởng của vòng A tại δ 8,01 (1H, s, H-2); 6,46 (1H, s, H-8) và một nhóm methoxy tại δ 3,89
(3H, s, OCH3-6) cho thấy vòng A bị thế ở vị trí penta. Các tín hiệu cộng hưởng còn lại tại δ 6,85 (2H, d, J=2,0 Hz, H-2′, 6′) và 7,02 (1H, d, J =1,5Hz, H-5′) cho thấy vòng C bị thế tại hai vị trí meta- và para-. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.23a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-7
Phổ 13C-NMR (Hình 4.23b) và DEPT 90, DEPT 135 của BS-7 chỉ ra tín hiệu của 16 cacbon gồm: 1x CH3 (δ 60,9); 5xCH và 10xCq trong đó tín hiệu của nhóm C=O (C-4) tại δ 182,4. So sánh số liệu phổ của BS-7 với các giá trị tương ứng đã
được công bố cho hợp chất 3′,4′,5,7- tetrahydroxy-6-methoxyisoflavone [95] cho phép xác định cấu trúc chất BS-7 là 3′, 4′, 5, 7- tetrahydroxy-6-methoxyisoflavone hay Irilin D.
Hình 4.23c Phổ khối ESI-MS của chất BS-7 O O OH OH OH H3CO HO 2 3 4 5 6 7 1' 3' 4' 5' 6' 8 9 10 2' Hình 4.23d Cấu trúc của hợp chất BS-7 (Irilin D) Hợp chất BS-8 (22)
Chất BS-8 nhận được ở dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H-NMR (Hình 4.24a) của BS-8 xuất hiện tín hiệu của 6 nhóm metyl tại δ 0,77; 0,81; 0,82; 0,83; 0,90 và 0,96 trong đó có cặp tín hiệu dublet tại 0,82 (H-26) và 0,81 (H-27) cùng có hằng số tương tác J=7,0 Hz thể hiện tương tác geminal của dimetyl trên nhóm metin [-CH(CH3)2]. Tín hiệu của một dublet tại δ 5,33 với hằng số tương tác
J=5 Hz cho thấy sự có mặt của một nối đôi tại C5-C6, cùng với một multiplet tại δ
3,46 (1H, m, H-3) cho thấy BS-8 là dẫn xuất của sitosterol. Ngoài ra trên phổ còn xuất hiện tín hiệu của một proton anomer tại δ 4,22 với hằng số tương tác lớn J=7,0 Hz cùng với 4 tín hiệu proton của 4 nhóm OH trong vùng 4,39 đến 4,85 cho phép dựđoán sự có mặt của một phân tửđường glucose trong phân tử hợp chất.
Hình 4.24a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-8
Điều này được khẳng định thêm bởi tín hiệu trên phổ13C-NMR (Hình 4.24b) với 29 cacbon, trong đó tín hiệu của cacbon anomer tại δ 100,7 và 5 tín hiệu còn lại của đường glucose tại 73,3; 76,4; 70,1; 76,7 và 60,1.
Từ các phân tích trên kết hợp với kết quả phổ khối lượng ESI-MS với pic ion tại m/z 575 [M-H]- tương ứng với công thức phân tử C35H60O6 (M = 576) và sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ 13C-NMR của BS-8 với tài liệu đã công bố [90] cho phép xác định cấu trúc chất BS-8 là sitosterol-3-O- β-D-glucopyranoside hay daucosterol. O H HO H HO H H OH H OH O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Hình 4.24c Cấu trúc của hợp chất BS-8 (daucosterol) Hợp chất BS-9 (23)
Hợp chất BS-9 thu được dưới dạng chất bột màu trắng, nóng chảy ở 256- 257oC.
Các tín hiệu trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân và cacbon có các tín hiệu tương tự như các hợp chất isoflavonoid nhưBS-1, BS-2 cho phép chúng tôi dựđoán
đây là môt hợp chất isoflavonoid. Trên phổ 1H-NMR (Hình 4.25a) thấy sự có mặt của một vòng thơm thế para- thông qua sự xuất hiện của hai tín hiệu doublet tại δH
7,40 (H-2′, 6′) và 6,83 (H-3′, 5′) với hằng số tương tác J=8,5 Hz và cường độ tích phân của mỗi tín hiệu là 2H. Một tín hiệu singlet tại δH 8,43 của proton H-2 và một tín hiệu singlet khác tại δH 6,88 của proton H-8 của vòng A bị thế tại 5 vị trí của khung isoflavonoid. Sự có mặt một gốc đường glucose được xác định bởi các tín hiệu tại δH 5,08 (d, J=7,5 Hz, H-1ʺ), 3,36 (m, H-2ʺ), 3,34(m,H-3ʺ), 3,19 (dd, J=9 Hz, J=8 Hz, H-4ʺ), 3,44 (m, H-5ʺ), 3,73 (d, J=10,5 Hz, Ha-6ʺ), 3,45 (d, J=7,5 Hz, Hb-6ʺ), trong đó hằng số tương tác JH-1”/H-2” là 7,5 Hz cho thấy có sự hình thành liên kết O-glucoside và cấu hình β của proton anome (vicinal H-1ʺ/H-2ʺở vị trí trans).
Hình 4.25a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-9
Trên phổ13C-NMR và DEPT xuất hiện 20 tín hiệu tương ứng với 22 nguyên tử cacbon do hai tín hiệu CH tại δC 130,11 và 115,05 xuất hiện với cường độ cao gấp đôi các tín hiệu CH khác, đồng thời mỗi tín hiệu này có liên hệ với hai proton tương ứng tại δH 7,40 (H-2′, H-6′) và 6,83 (H-3′, H-5′) trên phổ HSQC (Hình 4.25c). Các tín hiệu thu được trên phổ13C-NMR kết hợp với các tín hiệu thu được từ phổ DEPT-90 và DEPT-135 (Hình 4.25b) cho thấy 22 nguyên tử cacbon của hợp chất BS-9 được xác định tương ứng với chín cacbon bậc 4, 11 nhóm metin, một nhóm metylen và một nhóm metyl. Xem xét từng phần cấu hình của chất này có thể
thấy rằng phần khung flavon với 15 tín hiệu tại δC 154,6 (C-2); 121,1 (C-3); 180,70 (C-4); 152,8 (C-5); 132,4 (C-6); 156,5 (C-7); 94,0 (C-8); 152,4 (C-9); 106,4 (C-10); 122,0 (C-1′); 130,1 (C-2′, 6′); 115,0 (C-3′, 5′) và 157,4 (C-4′); 6 tín hiệu khác nằm trong vùng trường cao của các tín hiệu của một gốc đường tại δC 100,17 (C-1ʺ); 73, 11 (C-2ʺ); 76,67 (C-3ʺ); 69,64 (C-4ʺ); 77,26 (C-5ʺ) và 60,64 (C-6ʺ). Một tín hiệu singlet khác trên phổ 1H-NMR tại δH 3,80 và tương ứng trên phổ 13C-NMR tại δC
Hình 4.25b Phổ cộng hưởng từ 13C- và DEPT của chất BS-9
Phổ HMBC (Hình 4.25d) cho thấy H-1ʺ (δH 5,08) có tương tác với C-7 (δC
156,5), cho thấy rõ có liên kết O-glucoside tại C-7. Các proton của nhóm OCH3 (δH
3,80) có tương tác với C-5 (δC 152,8) và C-7 (δC 156,5) chứng tỏ nhóm OCH3được gắn vào vị trí C-6 của khung isoflavon. Phổ ESI-MS của hợp chất BS-9 cho pic ion phân tử tại m/z 463 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C22H22O11. So sánh các dữ liệu phổ thu được của hợp chất BS-9 với tài liệu tham khảo [34] thấy hoàn toàn phù hợp. Vì vậy, hợp chất BS-9được xác định là tectoridin.
Hình 4.25d Phổ HMBC của chất BS-9 O O OH O MeO OH O H HO H HO H H OH H OH 1' 4' 2 3 4 5 6 7 1" Hình 4.25e Cấu trúc của hợp chất BS-9 (Tectoridin) Hợp chất BS-10 (24)
Chất BS-10 phân lập được ở dạng bột vô định hình, màu vàng. Các dữ liệu phổ
NMR (Hình 4.26a) của BS-10 tương tự BS-9, cho thấy đây là một dẫn xuất flavonoit glycoside với các tín hiệu đặc trưng của phần aglycon tại δH 8,43 (1H, s,