2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254
(Merck 1,05715), RP18 F254 (Merck). Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng thủy tinh tráng sẵn Merck 60 F254, RP18 F254 (Merck) kích cỡ 20x20 cm. Phát hiện vệt chất bằng đèn tử
ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử
là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại trong dung môi thích hợp.
2.2.3 Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 – 0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo RP-18 F254 (Merck 5559; 0,2 mm) hoặc YMC có cỡ hạt là 30-50 µm (Fujisilisa Chemical Ltd.)
2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT
Để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được, sử dụng kết hợp các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu tham khảo.
2.3.1 Điểm nóng chảy
Điểm nóng chảy được đo trên máy BOTIUS (Heiztisch Mikroskop) của Đức.
2.3.2 Phổ khối lượng
Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS của Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc.
2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Avance 500, 1H- (500 MHz) và 13C- (125 MHz) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC 2.4.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vivo của các dịch chiết 2.4.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vivo của các dịch chiết
2.4.1.1 Xác định khả năng kháng viêm theo đường bôi
Phương pháp gây viêm cục bộ bằng hoạt chất EPP được tiến hành theo phương pháp của Mrudula Kale (2007) [108], Jaijoy K (2010) [77].
b. Phương pháp xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất theo đường bôi
Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất được tiến hành theo phương pháp của Jaijoy K (2010) [77].
2.4.1.2 Xác định khả năng kháng viêm theo đường uống
a. Phương pháp gây viêm cục bộ bằng Fomalin 1%
Phương pháp gây viêm được tiến hành theo phương pháp của Miklos Gabor (2009) [48].
b. Phương pháp xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất theo đường uống
Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất được tiến hành theo phương pháp của Miklos Gabor (2009) [48].
2.4.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC (dendritic cells) sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS DC (dendritic cells) sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS (lipopolysaccharide) của các hợp chất phân lập được từ cây sâm đại hành [84]
- Được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học Hàn Quốc.
- Đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất đến khả năng sống sót của tế bào bằng cách sử dụng thiết bịđo màu MTT.
- Nghiên cứu ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua sinh ra ở tuỷ
xương.
2.4.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo và độ an toàn của Tectorigenin (TEC-01) phân lập được từ thân rễ cây xạ can (TEC-01) phân lập được từ thân rễ cây xạ can
2.4.3.1 Nghiên cứu tác dụng kháng viêm, giảm đau của tectorigenin
Được tiến hành tại bộ môn Dược lý, trường Đại học Dược Hà Nội.
a. Nghiên cứu tác dụng giảm đau theo phương pháp gây đau bằng acid acetic (Afzal M.) [12]
b. Nghiên cứu tác dụng chống viêm
Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp của TEC-01 trên mô hình gây phù thực nghiệm bằng carrageenin [12].
Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn của TEC-01 trên chuột cống gây u hạt thực nghiệm.
2.4.3.2 Nghiên cứu độ an toàn của TEC-01
Phương pháp đánh giá độ an toàn của TEC-01 được tiến hành tại Bộ môn Dược lý, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương.
a. Phương pháp đánh giá độc tính cấp [141]
Nguyên lý của thử nghiệm: Thử độc tính cấp là xác định các mức liều gây
độc (chết) động vật thí nghiệm sau khi cho dùng một lần hoặc vài lần mẫu thử trong ngày. Trong trường hợp các mẫu thử ít độc hoặc không độc, có thể xác định mức liều dung nạp tối đa.
Tiến hành đánh giá độc tính cấp theo đường uống: Cho từng lô chuột nhắt trắng (từ 6-10 chuột/lô) uống chế phẩm thử với liều tăng dần, theo dõi chuột liên tục trong vòng 4 giờ, tỷ lệ chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau khi dùng chế phẩm thử.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai,
đuôi), lông, phân ...
- Tỷ lệ chuột chết trong vòng 72 giờ.
- Khi có chuột chết, mổđể quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng. LD50được tính theo công thức của Behrens
( 50 – a) x d LD50 = A + --- b – a
Trong đó: A - liều gây chết a% động vật thí nghiệm (ĐVTN) a - % ĐVTN chết sát dưới 50%
b - % ĐVTN chết sát trên 50% d - khoảng cách giữa các liều (g) Sai số chuẩn tính theo công thức:
kSd (SLD50)2 = ---
Trong đó: k: hệ số Behrens = 0,66 d: khoảng cách giữa các liều n: số chuột trong mỗi nhóm. LD84 - LD16 S = --- 2
Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Behrens.
b. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được tiến hành theo phương pháp của OECD [142]. Theo dõi các thông số: tình trạng toàn thân, huyết học, chức năng gan, chức năng thận và mô bệnh học.
2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các giá trị được mô tả dưới dạng TB ± SE (TB: giá trị trung bình, SE: sai số
chuẩn), và áp dụng phân tích một chiều (ANOVA), kết hợp phương pháp t-test- Student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi giá trị p<0.05.
CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM
3.1 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 3.1.1 Xử lý nguyên liệu thực vật 3.1.1 Xử lý nguyên liệu thực vật
Mẫu thực vật sau khi được thu hái về được xử lý theo phương pháp thông thường trong hóa học: sau khi làm sạch cơ học mẫu được diệt men ở 110oC và sấy khô ở nhiệt độ 40oC, sau đó đem nghiền nhỏ và ngâm chiết với methanol ở 50oC. Quá trình chiết được lặp lại 3-4 lần. Gộp các dịch chiết và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng methanol dùng làm nguyên liệu để điều chế các phần chiết.
3.1.2 Điều chế các cặn chiết từ củ sâm đại hành và thân rễ cây xạ can
Các cặn chiết từ củ sâm đại hành và thân rễ xạ can được điều chế theo sơđồ
hình 3.1:
Hình 3.1 Sơđồđiều chế các cặn chiết từ củ sâm đại hành và thân rễ cây xạ can
Thực hiện quá trình chiết kết hợp siêu âm và gia nhiệt, 5kg bột khô củ sâm
đại hành trong dung môi methanol 70% ở 50oC (3 lần x 2 giờ mỗi lần). Dịch chiết Bột khô thân rễ xạ can/củ sâm đại hành - Chiết methanol 70%, 500C - Cất loại dung môi Cặn methanol tổng Dịch còn lại Cặn n-hexan BS-Hx/EB-Hx Cặn ethyl acetate BS-Et/EB-Et Cặn nước BS-W/EB-W Dịch còn lại - Bổ sung nước
- Chiết n-hexan, cất loại dung môi
Chiết etyl axetat, cất loại dung môi
methanol được gộp chung lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 200 g cặn chiết methanol tổng. Hòa tan cặn methanol tổng trong nước và lần lượt chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexane, ethyl acetate thu được các dịch chiết tương ứng. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 40 g cặn chiết
n-hexane (ký hiệu EB/Hx), 53 g cặn chiết ethyl acetate (ký hiệu EB/Et) và 67 g cặn nước (ký hiệu EB/W).
Bột khô thân rễ Xạ can (2 kg) được ngâm chiết với methanol 70% ở nhiệt độ
500C, quá trình chiết được lặp lại 3 lần, dịch chiết được lọc, gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 33 gam cặn chiết methanol. Cặn methanol này
được bổ sung nước và chiết phân bố lần lượt với n-hexane, ethyl acetate, sau khi loại dung môi thu được các cặn chiết tương ứng là: 4,5 gam n-hexane (BS/Hx), 23 gam ethyl acetate (BS/Et) và 4,7 gam cặn nước (BS/W).
3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA CỦ SÂM ĐẠI HÀNH VIÊM CỦA CỦ SÂM ĐẠI HÀNH
3.2.1 Nghiên cứu thành phần hoá học
3.2.1.1 Quy trình phân lập các hợp chất
- Từ cặn chiết ethyl acetate:
Hình 3.2 Sơđồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat của củ sâm đại hành
Cặn EB/Et
SKC, SiO2, gradient HX:Aceton(40:1 -1:1)
EB-A EB-B EB-C EB-D
SKC, SiO2 CHCl3:Aceton 10:1) SKC, SiO2 HX:Aceton (5:1) EB-14 (10mg)
EB-B1 EB-B2 EB-B3 EB-B4
EB-2 (12mg) EB-10 (8mg) SKC, YMC RP-18, MeOH:H2O (6:1) EB-4 (5mg) (9mg) EB-5 (15mg) EB-6 SKC, YMC RP-18 Aceton:H2O (3:1)
Cặn chiết ethyl acetate EB/Et (53 g) của củ sâm đại hành được tiến hành chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:aceton (40:1 → 1:1, v/v) thu được bốn phân đoạn nhỏ EB-A, EB-B, EB-C, và EB-D. Tiến hành chạy sắc ký cột silica gel phân đoạn EB-B với hệ dung môi rửa giải CHCl3-aceton (10:1, v/v) thu được bốn phân đoạn từ EB-B1 đến EB-B4. Từ phân đoạn EB-B1, chạy sắc ký cột pha
đảo YMC-18 RP với hệ dung môi rửa giải MeOH- H2O (6:1, v/v) thu được chất
EB-2 (12,0 mg) và EB-10 (8,0 mg). Bằng phương pháp tương tự chạy sắc ký cột pha đảo với chất hấp phụ YMC-18 RP đối với phân đoạn EB-B3, hệ dung môi rửa giải là aceton:H2O (3:1, v/v) thu được chất EB-4 (5,0 mg), EB-5 (9,0 mg), và EB-6
(15,0 mg). Tiếp tục xử lý phân đoạn EB-D bằng cách chạy sắc ký cột silica gel và hệ dung môi n-hexane:aceton (5:1, v/v) thu được chất EB-14 (10,0 mg).
- Từ cặn nước:
Hình 3.3 Sơđồ phân lập các hợp chất từ cặn nước của củ sâm đại hành
Từ phần cặn nước (EB/W, 67 g) chạy sắc ký cột Dianion HP-20 với dung dịch MeOH có nồng độ tăng dần (0%, 25%, 50%, 75%, và 100%) thu được 5 phân đoạn: EB-E, EB-F, EB-G, EB-H và EB-K. Phân đoạn EB-G chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O (5:1:0,15, v/v/v) thu được 3 phân đoạn: EB-G1, EB-G2, và EB-G3. Từ phân đoạn EB-G1, chạy sắc ký cột pha đảo, chất hấp phụ
Cặn EB-W
SKC, Dianion HP-20P, dd MeOH (0%, 25%, 50%, 75%, 100%)
EB-E EB-G EB-H EB-K
SKC, SiO2 CHCl3:MeOH:H2O (5:1:0,15) SKC, LH-20 MeOH EB-1 (5mg) EB-3 (9mg)
EB-G1 EB-G2 EB-G3
EB-7 (12mg) (15mg) EB-8 SKC, YMC RP- 18,Aceton:H2O (1:2) EB-9 (8mg) EB-12 (9mg) (14mg) EB-13 SKC, YMC RP-18 MeOH:H2O (1:1) EB-F EB-11 (19mg)
YMC-18 RP và hệ dung môi rửa giải acetone:H2O (1:2, v /v) thu được chất EB-7
(12,0 mg), EB-8 (15,0 mg), và EB-9 (8,0 mg). Phân đoạn EB-G3 chạy sắc ký cột YMC RP-18 YMC, hệ dung môi MeOH:H2O (1:1, v/v) thu được chất EB-12 (9,0 mg) và EB-13 (14,0 mg). Với phân đoạn EB-K, chúng tôi chạy sắc ký cột sephadex LH-20 với chất rửa giải MeOH thu được chất EB-1 (5,0 mg), EB-3 (9,0 mg), và
EB-11 (19,0 mg).
3.2.1.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được Hợp chất EB-1 (1) Hợp chất EB-1 (1)
Chất bột màu vàng nhạt; [α]25D –58,1 (MeOH, c = 0,3); ESI-MS m/z 419 [M‒H]–; HR-ESI-MS m/z 455,1126 [M+Cl]– (C21H24O9Cl; 455,1114), m/z 419,1338 [M‒H]– (C21H23O9; 419,1348), m/z 257,0818 [M‒Glc]– (C15H13O4; 257,0819). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,87 (1H, ddq, J=4,0; 6,1; 12,0 Hz, H-2); 2,57 (1H, dd, J=4,0; 16,8 Hz, Hb-3); 2,62 (1H, dd, J=12,0; 16,8 Hz, Ha-3); 6,85 (1H, s, H-6); 6,67 (1H, s, H-7); 6,45 (1H, s, H-9); 1,46 (1H, d, J=6,1 Hz, 2- Me); 2,45 (1H, s, 5-Me); 4,93 (1H, d, J=7,2 Hz, H-1′); 3,40 (1H, H-2′); 3,47 (1H, H-3′); 3,31 (1H, d, J=8,5 Hz, H-4′); 3,42 (1H, H-5′); 3,62 (1H, dd, J=5,6; 12,2 Hz, Hb-6′); 3,83 (1H, dd, J=2,2; 12,2 Hz, Ha-6′). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 163,4 (C-1); 78,0 (C-2); 45,9 (C-3); 194,3 (C-4); 114,6 (C-4a); 137,6 (C-5); 124,2 (C-6); 141,4 (C-6a); 103,6 (C-7); 161,4 (C-8); 103,5 (C-9); 158,7 (C-10); 109,9 (C-10a); 20,7 (2-Me); 23,3 (5-Me); 101,7 (C-1′); 74,8 (C-2′); 78,0 (C-3′); 71,4 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,5 (C-6′).
Thuỷ phân hợp chất EB-1
Hoà tan hợp chất EB-1 trong dung dịch HCl 0,1 N (dioxane/H2O, 1:1, v/v, 1,0 ml) rồi đun cách thuỷ ở 800C trong 3h. Sau đó, dung dịch axit được trung hoà bởi Ag2CO3, và dung môi được loại bỏ triệt để bởi khí N2, sau đó chiết với CHCl3
được lớp CHCl3 và lớp nước. Lớp CHCl3đem tiến hành sắc ký lớp mỏng điều chế
với hệ dung môi CHCl3-MeOH (8:1, v/v) thu được hợp chất EB-1a.
Lớp nước được làm khô kiệt bởi khí N2, phần cặn hoà tan trong 0,1 ml pyridine khô rồi thêm vào đó este L-cysteine methyl hydrochloride trong pyridin (0,06 M, 0,1 mL). Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 600C trong 2 giờ rồi bổ
sung thêm 0,1 ml dung dịch trimethylsilylimidazole và tiếp tục gia nhiệt đến 600C trong 1,5 giờ. Sản phẩm sau khi được làm khô được phân bố với n-hexan (0,1 ml) và H2O (0,1 ml), lớp n-hexan được phân tích bằng sắc ký khí lỏng GC (cột SPB-1 (0,25 mm×30 m), detector FID, nhiệt độ cột 2100C, nhiệt độ tiêm 2700C, nhiệt độ
detector 3000C, khí mang He (2,0 ml/phút)). Thời gian lưu của peak được phát hiện
ở 14,11 phút. Với những điều kiện trên thì peak của đường chuẩn D-glucose và L- glucose có thời gian lưu tương ứng là 14,11 và 14,26 phút. Do đó, có thể xác định
được gốc đường của EB-1 là D-glucose.
Hợp chất EB-1a Chất bột màu vàng nhạt; 25 ] [α D – 38,3 (MeOH, c = 0,3); HR-ESI-MS m/z 257,0810 [M-H]‒ (C15H13O4; 257,0819). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,88 (1H, H-2); 2,72 (1H, dd, J=3,7; 16,8 Hz, Hb-3); 2,80 (1H, dd, J=12,0; 16,8 Hz, Ha-3); 6,90 (1H, s, H-6); 6,48 (1H, d, J=2,2 Hz, H-7); 6,35 (1H, d, J=2,2 Hz, H-9); 1,60 (1H, d, J=6,1 Hz, 2-Me); 2,59 (1H, s, 5-Me). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 163,8 (C-1); 77,9 (C-2); 46,0 (C-3); 194,0 (C-4); 113,7 (C-4a); 137,3 (C-5); 123,3 (C-6); 141,7 (C-6a); 102,6 (C-7); 162,0 (C-8); 102,9 (C-9); 158,9 (C-10); 108,3 (C-10a); 20,8 (2-Me); 23,4 (5-Me).
Hợp chất EB-2 (2) Chất bột màu trắng, mp.>3100C, C15H12O4, ESI-MS m/z 257 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,19 (1H, s, H-6); 6,56 (1H, s, H-7); 6,58 (1H, s, H-9); 2,37 (1H, s, 2-Me); 2,71 (1H, s, 5-Me); 10,05 (1H, s, 8-OH); 10,15 (1H, s, 10-OH). 13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,8 (C-1a), 163,5 (C-2); 112,1 (C- 3); 178,6 (C-4); 116,3 (C-4a); 134,4 (C-5); 124,8 (C-6); 138,7 (C-6a); 102,9 (C-7); 156,9 (C-8); 101,2 (C-9); 159,3 (C-10); 107,2 (C-10a); 19,4 (2-Me); 23,0 (5-Me).
Hợp chất EB-3 (3)
Chất bột màu trắng, mp. 175-1760C, C21H22O9, ESI-MS m/z 417 [M-H]¯.
1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,27 (1H, s, H-6); 6,89 (1H, d, J=2,1 Hz, H-7); 6,66 (1H, d, J=2,1 Hz, H-9); 2,35 (1H, s, 2-Me); 2,70
(1H, s, 5-Me); 4,98 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,24 (1H, t, J=7,6 Hz, H-2′); 3,36 (1H, m, H-3′); 3,19 (1H, t, J=8,3 Hz, H-4′); 3,28 (1H, m, H-5′); 3,69 (1H, dd, J=1,2; 11,4 Hz, Ha-6′); 3,49 (1H, dd, J=5,5; 11,4 Hz, Hb-6′).
13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,3 (C-1a), 163,7 (C-2); 112,1 (C- 3); 178,5 (C-4); 117,1 (C-4a); 134,7 (C-5); 125,5 (C-6); 138,1 (C-6a); 101,5 (C-7); 158,5 (C-8); 103,1 (C-9); 156,5 (C-10); 108,7 (C-10a); 19,5 (2-Me); 23,0 (5-Me); 100,0 (C-1′); 73,2 (C-2′); 77,1 (C-3′); 69,6 (C-4′); 76,7 (C-5′); 60,6 (C-6′).
Hợp chất EB-4 (4)
Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp. 175-176oC, C16H16O5, ESI-MS m/z
289 [M+H]+.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,49 (1H, q, J=7,0 Hz, H-1); 4,69 (1H, q, J=7,0 Hz, H-3); 8,04 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,38 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 7,01 (1H, t, J=8,0 Hz, H-8); 1,64 (3H, d, J=7,0 Hz, 1-Me); 1,53 (3H, d, J=7,0 Hz, 3- Me); 4,07 (3H, s, 9-OMe); 12,82 (1H, s, 5-OH).
13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 (C-1); 69,5 (C-3); 202,9 (C-4); 153,4 (C-5); 118,1 (C-6); 125,4 (C-7); 109,1 (C-8); 155,7 (C-9); 139,4 (C-10); 121,0 (C-11); 107,8 (C-12); 126,0 (C-13); 119,6 (C-14); 17,4 (CH3-1); 16,3 (CH3- 3); 56,4 (OCH3-9).
Hợp chất EB-5 (5)
Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp. 175-1770C, C16H16O4, ESI-MS m/z
273 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,36 (3H, d, J=6,5 Hz, 3-CH3); 1,54 (3H, d, J=6,5 Hz, 1-CH3); 2,20 (1H, dd, J=10,1; 18,1 Hz, 4-Hß); 2,75 (1H, dd, J=2,1; 18,1 Hz, 4-Hα); 3,60 (1H, m, H-3); 3,96 (3H, s, 9-OCH3); 4,85 (1H, q, J=6,5 Hz, H-1); 7,27 (1H, d, J=7,5 Hz, H-8); 7,64 (1H, dd, J=8,0; 8,5 Hz, H-7), 7,73 (1H, d, J=8,5 Hz, H-6). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 70,2 (C-1); 68,7 (C-3); 29,8 (C-4); 183,9 (C-5); 117,7 (C-6); 134,5 (C-7); 118,9 (C-8); 159,3 (C-9); 183,7 (C-10); 148,6 (C-11); 139,9 (C-12); 133,9 (C-13); 120,2 (C-14); 20,7 (1-CH3); 21,2 (3- CH3); 56,4 (9-OCH3).
Hợp chất EB-6 (6)
Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp 174-175oC, C16H16O4, ESI-MS m/z
273 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,35 (3H, d, J=6,0 Hz, 3-CH3); 1,53 (3H, d, J=7,0 Hz, 1-CH3); 2,24 (1H, dd, J=10,1; 16,0 Hz, 4-Hß); 2,71 (1H, dd, J=3,5; 18,5 Hz, 4-Hα); 3,98 (1H, m, H-3); 4,01 (3H, s, 9-OCH3); 5,02 (1H, q, J=6,5 Hz, H-1); 7,28 (1H, d, J=7,5 Hz, H-8); 7,65 (1H, t, J=7,5 Hz, H-7); 7,74 (1H, d, J=7,5 Hz, H-6). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 (C-1); 62,4 (C-3); 29,5 (C-4); 182,7 (C-5); 117,7 (C-6); 134,7 (C-7); 119,0 (C-8); 159,7 (C-9); 184,2 (C-10); 148,0 (C-11); 139,4 (C-12); 134,0 (C-13); 119,6 (C-14); 19,7 (1-CH3); 21,5 (2- CH3); 56,4 (9-OCH3). Hợp chất EB-7 (7)
Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O14, ESI-MS m/z 599 [M+H]+.
1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 5,02 (1H, q, J=6,2 Hz, H-1); 3,42 (1H, H-3); 2,68 (1H, dd, J=11,7; 16,5 Hz, Hb-4); 3,00 (1H, Ha-4); 8,07 (1H, d,
J=8,9 Hz, H-6); 7,28 (1H, dd, J=7,6; 8,9 Hz, H-7); 6,86 (1H, d, J=7,6 Hz, H-8); 1,49 (1H, d, J=6,2 Hz, 1-Me); 1,23 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 3,99 (1H, s, 9-OMe); 9,60 (1H, s, 10-OH); 4,51 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1′); 3,37 (1H, H-2′); 3,15 (1H, H-3′); 3,24 (1H, H-4′); 3,21 (1H, H-5′); 3,55 (1H, dd, J=5,5; 11,0 Hz, Hb-6′); 3,91 (1H, dd, J=1,4; 11,0 Hz, Ha-6′); 4,12 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1ʺ); 2,92 (1H, H-2ʺ); 3,10 (1H, H- 3ʺ); 3,03 (2H, H-4ʺ, H-5ʺ); 3,39 (1H, Hb-6ʺ); 3,61 (1H, br d, J=11,6 Hz, Ha-6ʺ). 13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 70,0 (C-1); 69,0 (C-3); 33,1 (C-4); 140,5 (C-5); 115,5 (C-6); 125,7 (C-7); 104,2 (C-8); 155,9 (C-9); 146,3 (C-10); 120,5 (C-11); 129,6 (C-12); 128,3 (C-13); 113,1 (C-14); 21,8 (1-Me); 21,7 (3-Me); 56,4 (9-OMe); 105,3 (C-1′); 74,1 (C-2′); 75,1 (C-3′); 69,9 (C-4′); 76,6 (C-5′); 68,6 (C-6′); 103,1 (C-1ʺ); 73,7 (C-2ʺ); 76,7 (C-3ʺ); 70,0 (C-4ʺ); 76,9 (C-5ʺ); 61,1 (C-6ʺ). Hợp chất EB-8 (8)
1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 5,21 (1H, q, J=6,8 Hz, H-1); 4.11 (1H, m, H-3); 2.46 (1H, dd, J=11,0; 17,2 Hz, Hb-4); 3.50 (1H, Ha-4); 7,90 (1H, d,
J=8,0 Hz, H-6); 7,31 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 6,85 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 1,56 (1H, d, J=6,8 Hz, 1-Me); 1,32 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 4,03 (1H, s, 9-OMe); 4,79 (1H, H-1′); 3,51 (1H, H-2′); 3.16 (1H, H-3′); 3,57 (1H, H-4′); 3,52 (1H, H-5′); 3,94 (1H, dd, J=4,8, 11,7 Hz, Hb-6′); 3,95 (1H, Ha-6′); 3,95 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 3,30 (1H, H-2ʺ); 3,22 (1H, H-3ʺ); 3,30 (1H, H-4ʺ); 3,30 (1H, m, H-5ʺ); 3,55 (1H, dd, J=6,2; 12,4 Hz, H-6aʺ); 3,53 (1H, dd, J=2,8; 12,4 Hz, H-6bʺ) . 13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 69,8 (C-1); 64,4 (C-3); 62,4 (C-4); 141,8 (C-5); 117,0 (C-6); 126,7 (C-7); 105,2 (C-8); 157,2 (C-9); 147,0 (C-10); 121,0 (C-11); 127,3 (C-12); 130,3 (C-13); 114,4 (C-14); 19,5 (1-Me); 22,2 (3-Me); 56,9 (9-OMe); 105,2 (C-1′); 75,5 (C-2′); 74,7 (C-3′); 71,2 (C-4′); 77,3 (C-5′); 70,8