Nghiên cứu độ an toàn của TEC

Một phần của tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb) và xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) (họ La dơn (Iridaceae)) (Trang 77)

Được tiến hành tại bộ môn dược lý, Viện kiểm nghiệm thuốc TW.

a. Đánh giá độc tính cp tính ca tectorigenin

Chun b mu th: * Th sơ b:

- Cách xử lý và chuẩn bị mẫu thử: Dùng hỗn dịch có chứa khoảng 0,1 g mẫu thử/ml nước cất (hỗn dịch A).

Cho 10 chuột uống hỗn dịch A, mỗi chuột 0,2ml (tương đương mức liều 1,0g mẫu thử/ kg chuột). Sau 24 giờ theo dõi không có chuột thí nghiệm bị chết.

- Thăm dò mức liều làm chết 100% số chuột thí nghiệm:

Cho 10 chuột uống hỗn dịch A, mỗi chuột 0,6 ml (tương đương mức liều 3,0g mẫu thử/ kg chuột). Sau 24 giờ theo dõi 100% chuột thí nghiệm bị chết.

* Th nghim chính thc: - Các mức liều thử nghiệm: Mức liều 1: 1,0 g mẫu thử/kg chuột Mức liều 2: 1,5 g mẫu thử/kg chuột Mức liều 3: 2,0 g mẫu thử/kg chuột Mức liều 4: 2,5 g mẫu thử/kg chuột Mức liều 5: 3,0 g mẫu thử/kg chuột - Cách xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu thử:

Cân chính xác một lượng mẫu thử, nghiền mịn, sau đó cho từ từ nước cất để

nghiền thành hỗn dịch đồng nhất. Thêm nước cất vừa đủđể thu được hỗn dịch chứa 0,1g mẫu thử/ ml nước cất (hỗn dịch thử).

Cách tiến hành:

- Chuột được nhịn ăn 15 giờ trước khi thí nghiệm, nước uống theo nhu cầu. Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm. Chuột đạt các yêu cầu về cân nặng được đưa vào thử nghiệm.

- Cách dùng: Đưa mẫu thử dưới dạng hỗn dịch theo đường uống. Lấy thể tích mẫu thử theo quy định đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù.

- Dựa trên kết quả thăm dò trong thử nghiệm sơ bộ, tiến hành thử nghiệm chính thức trên 50 chuột, chia thành 5 nhóm thử theo mức liều đã dự tính. Các nhóm thử được uống hỗn dịch thửở các mức liều và số lần đưa mẫu thử như sau:

Bng 3.1 Các nhóm th ung hn dch các liu khác nhau Nhóm chut Liu dùng (ml hn dch th / chut) Liu dùng (g mu th / kg chut) S chut thí nghim Mức liều 1 0,2 ml hd thử 1,0 g mẫu thử/ kg chuột 10

Mức liều 2 0,3 ml hd thử 1,5 g mẫu thử/ kg chuột 10 Mức liều 3 0,4 ml hd thử 2,0 g mẫu thử/ kg chuột 10 Mức liều 4 0,5 ml hd thử 2,5 g mẫu thử/ kg chuột 10 Mức liều 5 0,6 ml hd thử 3,0 g mẫu thử/ kg chuột 10 - Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống trong 24 giờđầu và theo dõi hoạt động của động vật thử nghiệm trong thời gian 7 ngày sau khi uống.

Theo dõi:

-Tiêu th thc ăn và ung ca chut:

Sau khi uống hỗn dịch thửở mức liều 1 không nhận thấy biểu hiện ngộđộc.

Ở mức liều 2, 3, 4 và 5, sau khi uống hỗn dịch thử, chuột có biểu hiện thở gấp, co giật và một số chuột chết trong khoảng 1-2 giờ, một số chuột chết sau 24 giờ và 48 giờ.

Số chuột sống sót sau khi cho uống 48 giờ ở các nhóm đều ăn uống, hoạt

động bình thường, không nhận thấy còn biểu hiện ngộđộc.

-Quan sát du hiu ngộđộc:

Sau khi uống hỗn dịch thử ở các mức liều 2, 3, 4 và 5, chuột có biểu hiện nằm mệt, thở gấp, co giật, một số chuột chết trong khoảng 1-2 giờ, một số chuột chết sau 24 giờ và 48 giờ. Chuột ở mức liều 1 không nhận thấy có biểu hiện ngộ độc.

b. Đánh giá độc tính bán trường din

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được tiến hành theo phương pháp của OECD (2005).

Chuột nhắt trắng được chia thành 3 lô, mỗi lô 10 con:

- Lô 1 (lô chứng): cho uống dung môi pha thuốc NaCMC (Sodium carboxymethyl cellulose) 1%.

- Lô 2 (lô thử 1): uống tectorigenin với liều 100 mg/kg cân nặng/ngày. - Lô 3 (lô thử 2): uống tectorigenin với liều 300 mg/kg cân nặng/ngày. Thuốc được pha để đảm bảo thể tích cho uống đồng đều ở tất cả các lô (0,1ml/kg cân nặng/ngày).

Chuột nhắt trắng được cho uống dung dịch NaCMC 1% hoặc tectorigenin hàng ngày vào 9 giờ sáng, liên tục trong 28 ngày. Tại 3 thời điểm: trước uống thuốc, sau 14 ngày và 28 ngày uống thuốc; giết chuột (mỗi thời điểm 10 con/lô) và lấy máu đểđánh giá các chỉ tiêu:

Những thông sốđược theo dõi:

- Tình trng toàn thân: hàng ngày theo dõi các hoạt động của chuột, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống, sự bài tiết (tình trạng lông, phân và nước tiểu). Theo dõi

trọng lượng chuột tại các thời điểm trước lúc bắt đầu dùng thuốc (N0); giữa khoảng thời gian dùng thuốc sau 14 ngày (N14) và ngay sau đợt dùng thuốc 28 ngày (N28).

- Huyết hc:Theo dõi số lượng hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ huyết sắc tố (Hb) tại các thời điểm: N14, N28.

-Chc năng gan: Theo dõi các thông số AST (aspartat amino transferase), ALT (alanin amino transferase), cholesterol toàn phần, protein toàn phần tại các thời

điểm N14, N28.

-Chc năng thn: Xác định nồng độ creatinin huyết tương tại các thời điểm N14, N28.

-Mô bnh hc: Sau 28 ngày thực nghiệm, giết 30% số chuột quan sát về đại thể và vi thể gan, thận của chuột ở các lô thực nghiệm.

X lý s liu: Kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn). Xử lý số liệu bằng chương trình Microsoft Excel theo phương pháp thống kê y học, sử dụng t-test Student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THÀO LUẬN 4.1 KT QU NGHIÊN CU V LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH

4.1.1 Xác định cu trúc các hp cht phân lp được t c sâm đại hành

Từ cặn etyl axetat (EB-Et) và cặn nước (EB-W) củ sâm đại hành, 14 hợp chất ký hiệu từ EB-1 đến EB-14 đã được phân lập, cấu trúc của các hợp chất đã được xác định bằng cách kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện

đại như sau:

Hp cht EB-1 (1) (Hp cht mi)

Hợp chất EB-1 thu được dưới dạng chất bột màu vàng nhạt; [α]25D –58,1 (MeOH, c = 0,3); phổ tử ngoại UV (MeOH) có các cực đại hấp thụ tại λmax (log ε) 223 (4,2), 261 (4,0) nm. Phổ hồng ngoại IR cho các đỉnh hấp thụ tại 3495 cm-1đặc trưng cho tín hiệu của nhóm –OH, 1640 cm-1đặc trưng cho tín hiệu của nhóm C=O và 1610 cm-1đặc trưng cho tín hiệu của C-O-C.

Hình 4.1a Ph khi phân gii cao HR-ESI-MS ca hp cht EB-1

Phổ ESI-MS cho pic ion cơ bản negative ở m/z 419 [M–H]–. Phổ phân giải cao HR-ESI-MS với pic ion cluster tại m/z 419,1338 [M–H]– (C21H23O9, 419,1342) phù hợp với công thức phân tử là C21H24O9.

Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của hợp chất EB-1 cho thấy các tín hiệu sau: 1 nhóm methyl bậc ba ởδH 245 ppm, 1 nhóm methyl bậc hai ởδH 1,46 ppm (d, J = 6,1 Hz), 3 proton thơm singlet ởδH 6,45 ppm (s, H-9), δH 6,67 ppm (s, H-7), và δH

6,85 ppm (s, H-6), và proton anomeric ởδH 4,93 ppm (d, J=7,2 Hz, H-1').

Hình 4.1b Ph cng hưởng t ht nhân 1H NMR ca hp cht EB-1

Hình 4.1c Ph cng hưởng t ht nhân 13C NMR ca hp cht EB-1

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất EB-1 cho thấy tín hiệu của 21 nguyên tử

C, tín hiệu cộng hưởng của 12 nguyên tử cacbon thơm hoặc olefin, 1 tín hiệu của nhóm cacbonyl ở δC 194,3 ppm (C-4), 5 tín hiệu của 5 nguyên tử cacbon ở δC từ

62,5 đến 78,3 ppm và 1 tín hiệu của nguyên tử cacbon ởδC 101,7 ppm (C-1') thuộc phần đường monosaccharide; 2 tín hiệu của hai nhóm methyl ởδC 20,7 ppm (2-Me)

và 23,3 ppm (5-Me). Phân tích các dữ liệu phổ trên cho thấy phần aglycone của EB- 1 được xác định là dihydroeleutherinol (EB-1a) (hình 4.1d).

Hình 4.1d Cu trúc ca hp cht EB-1a

Bng 4.1 D liu ph NMR ca hp cht EB-1 và aglycone EB-1a

V trí EB-1 EB-1a

δCa,b δHa,c (mult., J in Hz) HMBC (HC) δCa,b δHa,c (mult., J in Hz)

Aglycone 1a 163,4 ‒ 163,8 ‒ 2 78,0 4,87 (ddq, 4,0; 6,1; 12,0) 1a, 2-Me,3, 4 77,9 4,88* 3 45,9 2,57 (dd, 4,0; 16,8) 2,62 (dd, 12,0, 16,8) 2, 2-Me, 4 46,0 2,72 (dd, 3,7; 16,8) 2,80 (dd, 12,0; 16,8) 4 194,3 ‒ 194,0 ‒ 4a 114,6 ‒ 113,7 ‒ 5 137,6 ‒ 137,3 ‒

6 124,2 6,85 (s) 5-Me, 4a, 7, 10a 123,3 6,90 (s)

6a 141,1 ‒ 141,7 ‒ 7 103,6 6,67 (s) 6, 8, 9, 10a 102,6 6,48 (d, 2,2) 8 161,4 ‒ 162,0 ‒ 9 103,5 6,45 (s) 7, 8, 10, 10a 102,9 6,35 (d, 2,2) 10 158,7 ‒ 158,9 ‒ 10a 109,9 ‒ 108,3 ‒ 2-Me 20,7 1,46 (d, 6,1) 2, 3 20,8 1,60 (d, 6,1) 5-Me 23,3 2,45 (s) 4a, 5, 6 23,4 2,59 (s) 8-O- Glc 1ʹ 101,7 4,93 (d, 7,2) 8 2ʹ 74,8 3,40* 3ʹ 78,0 3,47* 4ʹ 71,4 3,31 (d, 8,5) 5ʹ 78,3 3,42* 6ʹ 62,5 3,62 (dd, 5,6; 12,2) 3,83 (dd, 2,2; 12,2) 4', 5'

Phổ HMBC của EB-1 cho thấy tương tác giữa H-2 (δH 4,87) với C-1a (δC

163,4), C-3 (δC 45,9), C-4 (δC 194,3), và 2-Me (δC 20,7); giữa H-3 (δH 2,57 và 2,62) với C-2 (δC 78,0), C-4 (δC 194,3), và 2-Me (δC 20,7) gợi ý nhóm methyl và nhóm carbonyl tương ứng ở vị trí C-2 và C-4 của vòng dihydropyrone. Mặt khác, trên phổ

HMBC còn xuất hiện tương tác giữa 5-Me (δH 2,45 ppm) với C-4a (δC 114,6 ppm), C-5 (δC 137,6 ppm), và C-6 (δC 124,2 ppm); giữa H-7 (δH 6,67) với C-6 (δC 124,2), C-8 (δC 161,4), C-9 (δC 103,5), và C-10a (δC 109,9); giữa H-9 (δH 6,45) với C-7 (δC

103,6), C-8 (δC 161,4), C-10 (δC 158,7), và C-10a (δC 109,9). Những dữ kiện này chứng tỏ vị trí nhóm methyl và hai nhóm hydroxyl tương ứng ở các vị trí C-5, C-8, và C-10.

Sự có mặt của một phân tửđường trong phân tử hợp chất EB-1được khẳng định thêm bằng việc thủy phân EB-1 trong môi trường axit thu được 1 đơn vịđường D- glucose và aglycone EB-1a. Ngoài ra, vị trí của đường glucose ở C-8 được khẳng

định thêm bởi tương tác giữa H-1' glc (δH 4,93) và C-8 (δC 161,4) trên phổ HMBC.

Hình 4.1f Các tương tác HMBC chính ca hp cht EB-1

Để xác định cấu hình tuyệt đối của C-2 trong phân từ hợp chất EB-1 chúng tôi

đã tiến hành ghi phổ CD của EB-1. Phổ CD của hợp chất EB-1 cho thấy hiệu ứng cotton xung quanh 319 nm (Hình 4.1g), tương tự như hợp chất (2S)-5-hydroxy-6,8- dimethoxy-2-methyl-4H-2,3-dihydronaphtho[2,3-b]-pyran-4-one, điều này gợi ý cấu hình ở C-2 của EB-1 là cấu hình S. 200 250 300 350 400 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 1 Wavelength (nm) M ol ar E ll ip ti ci ty [θθθθ ]×××× 1 0 3 Hình 4.1g Ph CD ca hp cht EB-1

Thêm vào đó để khẳng định thêm cấu hình của EB-1, chúng tôi đã xác định cấu hình aglycone EB-1a bằng cách so sánh độ quay cực của EB-1a với hợp chất 2- methylchroman-4-one và hợp chất (R)-dihydroeleutherinol ([α]25D = + 8,8) [95]. Độ

dihydroxy-2-methylchroman-4-one có độ quay cực là [α]D= – 58,6 và hợp chất (R) 7-methoxy-2-methylchroman-4-one có độ quay cực là [α]D= + 53,2 [115]. Điều này xác nhận hợp chất EB-1a có cấu hình ở C-2 là S. Do vậy, hợp chất EB-1được xác

định là (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside. Đây là hợp chất mới lần

đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên.

O O Me Me OH O EB -1 O OH HO HO HO Hình 4.1h Cu trúc ca hp cht EB-1 Hp cht EB-2 (2)

Hợp chất EB-2 thu được dưới dạng bột, màu trắng. Phổ khối lượng của hợp chất EB-2 cho pic ion phân tử [M+H]+ tại m/z 257 tương ứng với công thức phân tử

C15H12O4. Phổ UV hấp thụ các bước sóng cực đại tại λmax = 249, 270, 230 nm.

Trên phổ1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 1 proton olefin ởδH 6,18 ppm (1H, s, H-3), 1 proton thơm ởδH 7,19 ppm (1H, s, H-6), 1 đôi proton thơm ở vị trí meta so với nhau ởδH 6,56 ppm (1H, s, J=7,5Hz, H-7) và δH 6,58 ppm (1H, s, J=7,5 Hz, H-9). Hai tín hiệu của 2 nhóm methyl ởδH 2,40 ppm (3H, s, CH3-2) và δH 2,71 ppm (3H, s, CH3-5).

Tương ứng trên phổ 13C-NMR chỉ ra sự có mặt của 15 nguyên tử cacbon, trong đó có 2 nguyên tử C nhóm methyl ởδC 19,41 (CH3-2) và δC 22,97 (CH3-5), 1 nguyên tử C nhóm metin olefin ởδC 112,10 (C-3), 3 nguyên tử C nhóm metin thơm

ởδC 124,84 (C-6), 102,92 (C-7), 101,19 (C-9), 8 nguyên tử C bậc 4 và 1 nguyên tử

C nhóm cacbonyl vòng lacton ởδC 178,62.

Hình 4.2b Ph13C NMR ca hp cht EB-2

Kết hợp các dữ liệu phổ thu được của EB-2 với các số liệu phổ của eleutherinol của tài liệu tham khảo [49] thấy hoàn toàn trùng khớp, chúng tôi kết luận hợp chất EB-2 là eleutherinol. 2 4a 5 9 1a 6a 10a O O HO OH Hình 4.2c Cu trúc ca hp cht EB-2 (Eleutherinol)

Hp cht EB-3 (3)

Hợp chất EB-3 thu được dưới dạng bột, màu trắng. phổ khối lượng MS cho pic negative [M-H]¯ có m/z = 417 tương ứng với công thức phân tử C21H22O9.

Trên phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm methyl ở độ chuyển dịch hóa học δH 2,35 (3H, s, Me-2) và δH 2,70 (3H,s, Me-5); 1tín hiệu proton olefin

ởδH 6,18 (1H, s, H-3); 3 tín hiệu proton thơm ởδH 7,27 (1H, s, H-6), δH 6,89 (1H, d, 2,1 Hz, H-7) và δH 6,66 (1H, d, J=2,1 Hz, H-9). Ngoài ra còn có tín hiệu của 6 proton có độ chuyển dịch hóa học trong khoảng 3,19 và 3,69 ppm và 1 tín hiệu proton ở δH 4,98 (dublet) gợi ý sự có mặt của phần đường glucose. Các tín hiệu cộng hưởng thu được ở phổ13C-NMR cũng hoàn toàn phù hợp.

Hình 4.3a Ph1H NMR ca hp cht EB-3

Trên phổ 13C-NMR thấy xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 12 nguyên tử

cacbon thơm hoặc olefin ở δC từ 100 đến 163,7 ppm, 1 tín hiệu của nhóm cacbonyl

ở δC 178,5 ppm, 5 nguyên tử cacbon ở δC từ 60,6 đến 77,1 ppm và 1 nguyên tử

cacbon ởδC 100 ppm một lần nữa khẳng định sự tồn tại của gốc đường glucose; 2 tín hiệu nhóm methyl ởδC 19,5 (2-Me) và 23,0 (5-Me).

Hình 4.3b Ph13C NMR ca hp cht EB-3

Các liên kết giữa C và H được chỉ ra ở phổ HMQC đều phù hợp với các kết luận trên. Cấu hình dạng β của C anomeric được xác định dựa vào JH-1’,H-2’= 7,6 Hz. Phổ HMBC cho thấy sự tương tác giữa H-1’ (δH 4,98) và C-8 (δC 147,9) do đó phần

đường glucose gắn vào vị trí C-8 của phần khung aglycon.

So sánh với các dữ kiện phổ thu được của hợp chất EB-3 với hợp chất eleutherinoside A trong tài liệu tham khảo [49] thấy hoàn toàn trùng khớp. Do đó, có thể kết luận hợp chất EB-3 là eleutherinoside A. 1 3 4a 5 7 1a 10 10a 6a O OH GlcO O

Hình 4.3c Cu trúc hoá hc ca hp cht EB-3 (Eleutherinoside A)

Hp cht EB-4 (4)

Hợp chất EB-4 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, có nhiệt độ nóng chảy là 175-176oC.

Phổ hồng ngoại của hợp chất EB-4 cho thấy tín hiệu của các nhóm chức C=O với pic hấp thụ tại 1654 cm-1, nhóm OH với dải hấp thụ trong khoảng 3450 cm-1.

Hình 4.4a Ph IR ca hp cht EB-4

Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất EB-4 cho pic ion phân tử [M+H]+ tại

m/z 289 chỉ ra công thức phân tử của EB-4 C16H16O5 (M = 288).

Hình 4.4c Ph1H-NMR ca hp cht EB-4

Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-4 cho thấy sự xuất hiện của 3 proton thơm kề

nhau của vòng naphtho tại δH 8,04 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6), 7,38 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-7) và 7,01 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8); hai dublet tại δH 1,64 (3H, d, J = 7,0 Hz, 1- CH3) và 1,53 (3H, d, J = 7,0 Hz, 3-CH3) cho thấy sự xuất hiện của hai nhóm metyl tại C-1 và C-3; hai nhóm metin gắn với oxi của vòng pyran tại δH 5,49 (q, J = 7,0 Hz, H-1) và 4,69 (q, J = 7,0 Hz, H-3). Ngoài ra ở vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu singlet rộng cộng hưởng tại δH 12,82 ppm gợi ý sự có mặt của nhóm hydroxyl. Trên phổ1H-NMR của hợp chất EB-4 không thấy sự xuất hiện của hai proton nhóm metylen tại vị trí C-4 do hai proton này đã được thay thế bởi nguyên tử O, điều này

được khẳng định khi trên phổ13C-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng tại δC 202,9 ppm của nhóm cacbonyl và phổ tương tác xa HMBC thấy xuất hiện tương tác giữa H của nhóm metyl tại δH 1,53 (3H, d, J = 7,0 Hz, 3-CH3) với C-3 tại δC 69,5 ppm và C=O tại δC 202,9 ppm.

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất EB-4 cho thấy sự có mặt của 16 nguyên tử cacbon, trong đó có 10 cacbon thơm của khung naphtho (δC từ 107,8 đến

155,7 ppm), 1 nhóm cacbonyl tại δC 202,9 ppm (C-4), 2 nhóm metin gắn với oxi

Một phần của tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb) và xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) (họ La dơn (Iridaceae)) (Trang 77)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(183 trang)