a. Động vật thí nghiệm:
60 chuột BALB/c khoẻ mạnh, có khối lượng từ 25- 30g, được nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học, chia làm 10 lô (6 chuột/lô). Trong đó 8 lô xác định hoạt tính của 8 dịch chiết, lô 9 đối chứng chuẩn (bôi Dexamethasone) và lô 10 đối chứng âm (chỉ bôi acetone là dung môi hòa tan mẫu). Từ lô 1 đến lô 9
được gây viêm bằng cách bôi EPP vào cả 2 tai của chuột.
b. Gây viêm cục bộ bằng hoạt chất EPP
Phương pháp gây viêm được tiến hành theo phương pháp của Mrudula Kale (2007), Jaijoy K (2010). Bôi vào mỗi tai chuột một lượng EPP là 1 mg/1 tai chuột pha trong 20µl acetone.
c. Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất theo đường bôi
Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất được tiến hành theo phương pháp của Jaijoy K (2010). Cách tiến hành:
- Bôi 1 gam EPP (pha với 20 µl acetone)/1 tai vào cả 2 tai.
- Bôi chất cần kiểm tra hoạt tính kháng viêm ở nồng độ 3 mg/tai vào một tai. - Tai kia bôi acetone làm đối chứng 20 µl/tai.
- Dùng Dexamethasome 0,1 mg/tai trong 20 µl acetone (Sigma-Aldrich) làm
đối chứng chuẩn.
- Sau 45 phút gây viêm tiến hành cắt tai chuột, cân trọng lượng tai và tính phần trăm ức chế khối viêm theo phương pháp của Delporte el al (2002) (2005).
Phần trăm ức chế = 100 *(1– (Ws-Wa)/(Wc-Wa))
Trong đó: Wc: trọng lượng của tai đối chứng chỉ bôi EPP Ws: trọng lượng tai có bôi EPP và thử chất
Wa: trọng lượng tai bình thường, không bôi EPP và không thử chất
3.2.2.2 Xác định khả năng kháng viêm của các cặn chiết theo đường uống
a. Động vật thí nghiệm: 60 chuột BALB/c khoẻ mạnh, có khối lượng từ 25- 30g,
(6 chuột/lô), 8 lô xác định hoạt tính của 8 dịch chiết, lô 9 đối chứng chuẩn (cho uống Indomethacine) và lô 10 đối chứng âm (chỉ uống dung môi hòa tan mẫu, là dung dịch sinh lý). Cả 10 lô đều được gây viêm bằng cách tiêm Fomalin 1% vào một gan bàn chân chuột.
b. Gây viêm cục bộ bằng Fomalin 1%
Phương pháp gây viêm được tiến hành theo phương pháp của Miklos Gabor (2009): Tiêm dưới da gan bàn chân chuột 20 µl fomalin 1 % pha trong PBS.
c. Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất theo đường uống
Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất được tiến hành theo phương pháp của Miklos Gabor (2009). Theo đó, chuột uống hoạt chất ở nồng độ 60 mg/kgP. Sau 60 phút tiến hành tiêm dưới da gan bàn chân chuột 20 µl Fomalin 1 % pha trong dung dịch PBS và theo dõi biểu hiện của chuột. Sau 5 giờ kể từ khi tiêm fomalin thì tiến hành cắt cả bàn chân chuột, cân khối lượng để tính toán. Trong thí nghiệm, indomethacine được dùng làm đối chứng chuẩn và cho uống ở nồng độ 60 mg/kgP. Phần trăm ức chế khối viêm theo phương pháp của Delporte el al (2005) như sau:
Phần trăm ức chế = 100 *(1– (Ws1-Ws2)/(Wc1-Wc2)) Trong đó:
- Ws1: trọng lượng chân tiêm fomalin 1% của những con thử chất
- Ws2: trọng lượng chân không tiêm fomalin 1% của những con thử chất - Wc1: trọng lượng chân tiêm fomalin 1% của những con không thử chất - Wc2: trọng lượng chân không tiêm fomalin 1% của những con không thử
chất.
3.2.3 Nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của các hợp chất phân lập
được từ cây sâm đại hành
Động vật thí nghiệm: chuột không thuần chủng C57BL/6 được cung cấp từ
Viện Công nghệ sinh học Hàn Quốc.
- Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành đến khả năng sống sót của tế bào bằng phương pháp MTT: Bổ sung 20 µl
MTT (nồng độ 5mg/ml, trong đệm muối natri phosphate) vào mỗi giếng tế bào thử
nghiệm. Tiếp tục ủ trong tủ nuôi cấy duy trì nhiệt độ 37°C, không khí có chứa 10% CO2. Sau 2 giờ, hút loại bỏ môi trường, thêm vào 50µl DMSO vào mỗi giếng để
hòa tan tinh thể. Đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 550 nm bằng máy ELISA. Chỉ tiêu đánh giá: tỷ lệ tế bào sống sót sau nuôi cấy 24 giờ.
- Tuỷ xương được lấy từ xương ống và xương đùi của chuột bằng cách nhuộm màu với DMEM và được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có chứa 10% FBS (fetal bovine serum) (Gibco, NY, USA), 50 µM 2-ME và 2mM glutamine bổ sung 3% J558L dịch tế bào nuôi cấy chứa bạch cầu hạt của đại thực bào GM- CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating). Sau 6 ngày thu được các tế bào tua DC rồi đưa vào môi trường RPMI đã bổ sung 5% FBS.
- Các tế bào tua DCs được ủ trong đĩa 48 giếng ở nồng độ là 2.105 tế bào/ml, rồi được xử lý với các hợp chất ở nồng độ 25 µM trong 1 giờ trước khi kích thích với 10 ng/ml LPS từSalmonella minnesota (Alexis, NY, USA).
- Các hợp chất thể hiện hoạt tính sau đó được thử nghiệm tiếp ở các nồng độ
50,0, 25,0, 12,5 và 6,3 µM, dịch huyền phù được thu hoạch sau 16 giờ kích thích. - Nồng độ murine IL-12p40, IL-6 và TNF-α trong dịch nuôi cấy được phát hiện bằng máy ELISA (BD PharMingen, CA, USA).
Đối chứng dương là SB203580 ức chế sự sản sinh các cytokine IL-12p40, IL-6 và TNF-α với giá trị tương ứng là 5,2±0,1, 3,5±0,2 và 7,5±0,2 µg/ml.