Các cặn chiết metanol (BS-Me), hexan (BS-Hx), etyl axetat (BS-Et) và cặn nước (BS-W) của thân rễ xạ can được đánh giá hoạt tính kháng viêm sơ bộ tương tự
như của cặn chiết củ sâm đại hành (mục 3.2.2).
3.3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học và độ an toàn của tectorigienin phân lập
được từ thân rễ xạ can
3.3.3.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm, giảm đau in vivo của tectorigienin
* Động vật thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, khoảng 4-5 tuần tuổi cả 2 giống, khoẻ mạnh, có trọng lượng 18 - 22g. Chuột cống trắng, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 180 – 200 g, do Học viện Quân Y cung cấp. Động vật phải chưa được dùng vào bất kỳ
một thí nghiệm nào trước đó, đạt tiêu chuẩn thử nghiệm, được nuôi tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược lý Trường Đại học Dược, Hà Nội bằng thức ăn chuẩn do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp, cho uống nước tự do.
a. Nghiên cứu tác dụng giảm đau theo phương pháp gây đau bằng acid acetic (Koster)
- Lô 1 (chứng trắng): uống dung môi pha thuốc NaCMC 1% - Lô 2 (chứng dương): uống aspirin với liều 240 mg/kg
- Lô 3 (uống thuốc thử liều 1): uống tectorigenin với liều 50 mg/kg - Lô 4 (uống thuốc thử liều 2): uống tectorigenin với liều 100 mg/kg - Lô 5 (uống thuốc thử liều 3): uống tectorigenin với liều 200 mg/kg
Cho chuột uống thuốc thử, 30 phút sau tiêm vào màng bụng mỗi chuột 0,1 ml acid acetic 1%. Đếm số cơn đau quặn trong từng khoảng thời gian 5 phút một, kể từ
ngay sau khi tiêm acid acetic và theo dõi trong vòng 30 phút. Biểu hiện của cơn đau quặn là cơ bụng co lại và chi sau duỗi thẳng. Cách tính kết quả : Sc– St X ( % ) = × 100 Sc Trong đó: Sc: số cơn đau của lô chứng trắng St: số cơn đau của lô thử thuốc X: tỷ lệ giảm đau Sơđồ nghiên cứu: 30 phút Ghi lại số cơn đau quặn trong 30 phút
Cho chuột uống thuốc Tiêm màng bụng acid acetic 1%
Hình 3.6 Sơđồ nghiên cứu tác dụng giảm đau của tectorigenin trên mô hình giảm
đau quặn
b. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của tectorigenin trên mô hình gây phù thực nghiệm bằng carrageenin:
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 8 con. - Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%
- Lô 2 (lô chứng dương): uống indomethacin với liều 10mg/kg P - Lô 3 (lô thử): uống tectorigenin với liều 60 mg/kg P
Chuột được uống thuốc hai lần, lần thứ nhất một ngày trước khi gây viêm, lần thứ hai trước khi gây viêm 1 giờ. Tiến hành gây viêm bằng cách tiêm 0,1 ml
carrageenin 1% (pha trong nước muối sinh lý) vào gan bàn chân sau, chân bên phải của chuột.
Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng máy đo thể tích chân chuột vào các thời điểm: trước khi gây viêm, sau khi gây viêm 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 7 giờ, 24 giờ.
Sơđồ nghiên cứu:
Đo thể tích chân chuột
Uống Gây 1 giờ 2 giờ 4 giờ 5 giờ 7 giờ 24 giờ
thuốc viêm
Hình 3.7 Sơđồ nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của tectorigenin trên mô hình gây viêm bằng carrageenin
Kết quảđược tính toán theo công thức của Fontaine.
- Độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức: Vt – V0
∆V ( %) = × 100
V0 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó: V0 : thể tích chân chuột trước khi gây viêm Vt : thể tích chân chuột sau khi gây viêm ∆V: độ tăng thể tích chân chuột
- Tác dụng chống viêm cấp của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế
phản ứng phù: ∆Vc%–∆Vt%
I (%) = × 100
∆Vc %
Trong đó: ∆Vc%: giá trị trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô chứng (%) ∆Vt%: giá trị trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô thử (%) c. Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của tectorigenin trên chuột cống gây u hạt thực nghiệm:
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 9 con.
Gây viêm mạn bằng cấy viên sợi amian (30±1mg/con chuột) đã được tiệt trùng (ở 1200C trong 2 giờ) vào dưới da hai bên lưng chuột.
Sau khi cấy u hạt, cho chuột uống liên tục 7 ngày:
- Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1% - Lô 2 (lô chứng dương): uống prednisolon với liều 5mg/kg
- Lô 4 (lô thuốc thử): uống tectorigenin với liều 60mg/kg
Ngày thứ 8 tiến hành giết chuột bằng ether, bóc tách u hạt, cân khối lượng ướt của hạt rồi đem sấy ở 600C đến khối lượng không đổi (khoảng 18 giờ). Đem cân u hạt tính khối lượng khô.
Tác dụng chống viêm được tính theo công thức (Okoli et al., 2007) [15]: Tc― Tt
I% = × 100 Tc
Trong đó: Tc: trọng lượng khối u hạt lô chứng trắng
Tt: trọng lượng khối u hạt lô thử I: tỷ lệức chế u hạt Sơđồ nghiên cứu:
Uống thuốc liên tục trong 7 ngày
Gây viêm và uống thuốc Mổ chuột, cân u hạt
Hình 3.8 Sơđồ nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt bằng amian
3.3.3.2 Nghiên cứu độ an toàn của tectorigenin
Được tiến hành tại bộ môn dược lý, Viện kiểm nghiệm thuốc TW.
a. Đánh giá độc tính cấp tính của tectorigenin
Chuẩn bị mẫu thử: * Thử sơ bộ:
- Cách xử lý và chuẩn bị mẫu thử: Dùng hỗn dịch có chứa khoảng 0,1 g mẫu thử/ml nước cất (hỗn dịch A).
Cho 10 chuột uống hỗn dịch A, mỗi chuột 0,2ml (tương đương mức liều 1,0g mẫu thử/ kg chuột). Sau 24 giờ theo dõi không có chuột thí nghiệm bị chết.
- Thăm dò mức liều làm chết 100% số chuột thí nghiệm:
Cho 10 chuột uống hỗn dịch A, mỗi chuột 0,6 ml (tương đương mức liều 3,0g mẫu thử/ kg chuột). Sau 24 giờ theo dõi 100% chuột thí nghiệm bị chết.
* Thử nghiệm chính thức: - Các mức liều thử nghiệm: Mức liều 1: 1,0 g mẫu thử/kg chuột Mức liều 2: 1,5 g mẫu thử/kg chuột Mức liều 3: 2,0 g mẫu thử/kg chuột Mức liều 4: 2,5 g mẫu thử/kg chuột Mức liều 5: 3,0 g mẫu thử/kg chuột - Cách xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu thử:
Cân chính xác một lượng mẫu thử, nghiền mịn, sau đó cho từ từ nước cất để
nghiền thành hỗn dịch đồng nhất. Thêm nước cất vừa đủđể thu được hỗn dịch chứa 0,1g mẫu thử/ ml nước cất (hỗn dịch thử). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách tiến hành:
- Chuột được nhịn ăn 15 giờ trước khi thí nghiệm, nước uống theo nhu cầu. Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm. Chuột đạt các yêu cầu về cân nặng được đưa vào thử nghiệm.
- Cách dùng: Đưa mẫu thử dưới dạng hỗn dịch theo đường uống. Lấy thể tích mẫu thử theo quy định đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù.
- Dựa trên kết quả thăm dò trong thử nghiệm sơ bộ, tiến hành thử nghiệm chính thức trên 50 chuột, chia thành 5 nhóm thử theo mức liều đã dự tính. Các nhóm thử được uống hỗn dịch thửở các mức liều và số lần đưa mẫu thử như sau:
Bảng 3.1 Các nhóm thử uống hỗn dịch ở các liều khác nhau Nhóm chuột Liều dùng (ml hỗn dịch thử / chuột) Liều dùng (g mẫu thử / kg chuột) Số chuột thí nghiệm Mức liều 1 0,2 ml hd thử 1,0 g mẫu thử/ kg chuột 10
Mức liều 2 0,3 ml hd thử 1,5 g mẫu thử/ kg chuột 10 Mức liều 3 0,4 ml hd thử 2,0 g mẫu thử/ kg chuột 10 Mức liều 4 0,5 ml hd thử 2,5 g mẫu thử/ kg chuột 10 Mức liều 5 0,6 ml hd thử 3,0 g mẫu thử/ kg chuột 10 - Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống trong 24 giờđầu và theo dõi hoạt động của động vật thử nghiệm trong thời gian 7 ngày sau khi uống.
Theo dõi:
-Tiêu thụ thức ăn và uống của chuột:
Sau khi uống hỗn dịch thửở mức liều 1 không nhận thấy biểu hiện ngộđộc.
Ở mức liều 2, 3, 4 và 5, sau khi uống hỗn dịch thử, chuột có biểu hiện thở gấp, co giật và một số chuột chết trong khoảng 1-2 giờ, một số chuột chết sau 24 giờ và 48 giờ.
Số chuột sống sót sau khi cho uống 48 giờ ở các nhóm đều ăn uống, hoạt
động bình thường, không nhận thấy còn biểu hiện ngộđộc.
-Quan sát dấu hiệu ngộđộc:
Sau khi uống hỗn dịch thử ở các mức liều 2, 3, 4 và 5, chuột có biểu hiện nằm mệt, thở gấp, co giật, một số chuột chết trong khoảng 1-2 giờ, một số chuột chết sau 24 giờ và 48 giờ. Chuột ở mức liều 1 không nhận thấy có biểu hiện ngộ độc.
b. Đánh giá độc tính bán trường diễn
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được tiến hành theo phương pháp của OECD (2005).
Chuột nhắt trắng được chia thành 3 lô, mỗi lô 10 con:
- Lô 1 (lô chứng): cho uống dung môi pha thuốc NaCMC (Sodium carboxymethyl cellulose) 1%.
- Lô 2 (lô thử 1): uống tectorigenin với liều 100 mg/kg cân nặng/ngày. - Lô 3 (lô thử 2): uống tectorigenin với liều 300 mg/kg cân nặng/ngày. Thuốc được pha để đảm bảo thể tích cho uống đồng đều ở tất cả các lô (0,1ml/kg cân nặng/ngày).
Chuột nhắt trắng được cho uống dung dịch NaCMC 1% hoặc tectorigenin hàng ngày vào 9 giờ sáng, liên tục trong 28 ngày. Tại 3 thời điểm: trước uống thuốc, sau 14 ngày và 28 ngày uống thuốc; giết chuột (mỗi thời điểm 10 con/lô) và lấy máu đểđánh giá các chỉ tiêu:
Những thông sốđược theo dõi:
- Tình trạng toàn thân: hàng ngày theo dõi các hoạt động của chuột, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống, sự bài tiết (tình trạng lông, phân và nước tiểu). Theo dõi
trọng lượng chuột tại các thời điểm trước lúc bắt đầu dùng thuốc (N0); giữa khoảng thời gian dùng thuốc sau 14 ngày (N14) và ngay sau đợt dùng thuốc 28 ngày (N28).
- Huyết học:Theo dõi số lượng hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ huyết sắc tố (Hb) tại các thời điểm: N14, N28.
-Chức năng gan: Theo dõi các thông số AST (aspartat amino transferase), ALT (alanin amino transferase), cholesterol toàn phần, protein toàn phần tại các thời
điểm N14, N28.
-Chức năng thận: Xác định nồng độ creatinin huyết tương tại các thời điểm N14, N28.
-Mô bệnh học: Sau 28 ngày thực nghiệm, giết 30% số chuột quan sát về đại thể và vi thể gan, thận của chuột ở các lô thực nghiệm.
Xử lý số liệu: Kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn). Xử lý số liệu bằng chương trình Microsoft Excel theo phương pháp thống kê y học, sử dụng t-test Student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
CHƯƠNG 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT QUẢ VÀ THÀO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH
4.1.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành
Từ cặn etyl axetat (EB-Et) và cặn nước (EB-W) củ sâm đại hành, 14 hợp chất ký hiệu từ EB-1 đến EB-14 đã được phân lập, cấu trúc của các hợp chất đã được xác định bằng cách kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện
đại như sau:
Hợp chất EB-1 (1) (Hợp chất mới)
Hợp chất EB-1 thu được dưới dạng chất bột màu vàng nhạt; [α]25D –58,1 (MeOH, c = 0,3); phổ tử ngoại UV (MeOH) có các cực đại hấp thụ tại λmax (log ε) 223 (4,2), 261 (4,0) nm. Phổ hồng ngoại IR cho các đỉnh hấp thụ tại 3495 cm-1đặc trưng cho tín hiệu của nhóm –OH, 1640 cm-1đặc trưng cho tín hiệu của nhóm C=O và 1610 cm-1đặc trưng cho tín hiệu của C-O-C.
Hình 4.1a Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất EB-1
Phổ ESI-MS cho pic ion cơ bản negative ở m/z 419 [M–H]–. Phổ phân giải cao HR-ESI-MS với pic ion cluster tại m/z 419,1338 [M–H]– (C21H23O9, 419,1342) phù hợp với công thức phân tử là C21H24O9.
Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của hợp chất EB-1 cho thấy các tín hiệu sau: 1 nhóm methyl bậc ba ởδH 245 ppm, 1 nhóm methyl bậc hai ởδH 1,46 ppm (d, J = 6,1 Hz), 3 proton thơm singlet ởδH 6,45 ppm (s, H-9), δH 6,67 ppm (s, H-7), và δH
6,85 ppm (s, H-6), và proton anomeric ởδH 4,93 ppm (d, J=7,2 Hz, H-1').
Hình 4.1b Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR của hợp chất EB-1
Hình 4.1c Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C NMR của hợp chất EB-1
Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất EB-1 cho thấy tín hiệu của 21 nguyên tử
C, tín hiệu cộng hưởng của 12 nguyên tử cacbon thơm hoặc olefin, 1 tín hiệu của nhóm cacbonyl ở δC 194,3 ppm (C-4), 5 tín hiệu của 5 nguyên tử cacbon ở δC từ
62,5 đến 78,3 ppm và 1 tín hiệu của nguyên tử cacbon ởδC 101,7 ppm (C-1') thuộc phần đường monosaccharide; 2 tín hiệu của hai nhóm methyl ởδC 20,7 ppm (2-Me)
và 23,3 ppm (5-Me). Phân tích các dữ liệu phổ trên cho thấy phần aglycone của EB- 1 được xác định là dihydroeleutherinol (EB-1a) (hình 4.1d).
Hình 4.1d Cấu trúc của hợp chất EB-1a
Bảng 4.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất EB-1 và aglycone EB-1a
Vị trí EB-1 EB-1a
δCa,b δHa,c (mult., J in Hz) HMBC (H→C) δCa,b δHa,c (mult., J in Hz)
Aglycone 1a 163,4 ‒ 163,8 ‒ 2 78,0 4,87 (ddq, 4,0; 6,1; 12,0) 1a, 2-Me,3, 4 77,9 4,88* 3 45,9 2,57 (dd, 4,0; 16,8) 2,62 (dd, 12,0, 16,8) 2, 2-Me, 4 46,0 2,72 (dd, 3,7; 16,8) 2,80 (dd, 12,0; 16,8) 4 194,3 ‒ 194,0 ‒ 4a 114,6 ‒ 113,7 ‒ 5 137,6 ‒ 137,3 ‒
6 124,2 6,85 (s) 5-Me, 4a, 7, 10a 123,3 6,90 (s)
6a 141,1 ‒ 141,7 ‒ 7 103,6 6,67 (s) 6, 8, 9, 10a 102,6 6,48 (d, 2,2) 8 161,4 ‒ 162,0 ‒ 9 103,5 6,45 (s) 7, 8, 10, 10a 102,9 6,35 (d, 2,2) 10 158,7 ‒ 158,9 ‒ 10a 109,9 ‒ 108,3 ‒ 2-Me 20,7 1,46 (d, 6,1) 2, 3 20,8 1,60 (d, 6,1) 5-Me 23,3 2,45 (s) 4a, 5, 6 23,4 2,59 (s) 8-O- Glc 1ʹ 101,7 4,93 (d, 7,2) 8 2ʹ 74,8 3,40* 3ʹ 78,0 3,47* 4ʹ 71,4 3,31 (d, 8,5) 5ʹ 78,3 3,42* 6ʹ 62,5 3,62 (dd, 5,6; 12,2) 3,83 (dd, 2,2; 12,2) 4', 5'
Phổ HMBC của EB-1 cho thấy tương tác giữa H-2 (δH 4,87) với C-1a (δC
163,4), C-3 (δC 45,9), C-4 (δC 194,3), và 2-Me (δC 20,7); giữa H-3 (δH 2,57 và 2,62) với C-2 (δC 78,0), C-4 (δC 194,3), và 2-Me (δC 20,7) gợi ý nhóm methyl và nhóm carbonyl tương ứng ở vị trí C-2 và C-4 của vòng dihydropyrone. Mặt khác, trên phổ
HMBC còn xuất hiện tương tác giữa 5-Me (δH 2,45 ppm) với C-4a (δC 114,6 ppm), C-5 (δC 137,6 ppm), và C-6 (δC 124,2 ppm); giữa H-7 (δH 6,67) với C-6 (δC 124,2), C-8 (δC 161,4), C-9 (δC 103,5), và C-10a (δC 109,9); giữa H-9 (δH 6,45) với C-7 (δC
103,6), C-8 (δC 161,4), C-10 (δC 158,7), và C-10a (δC 109,9). Những dữ kiện này chứng tỏ vị trí nhóm methyl và hai nhóm hydroxyl tương ứng ở các vị trí C-5, C-8, và C-10.
Sự có mặt của một phân tửđường trong phân tử hợp chất EB-1được khẳng định thêm bằng việc thủy phân EB-1 trong môi trường axit thu được 1 đơn vịđường D- glucose và aglycone EB-1a. Ngoài ra, vị trí của đường glucose ở C-8 được khẳng
định thêm bởi tương tác giữa H-1' glc (δH 4,93) và C-8 (δC 161,4) trên phổ HMBC.
Hình 4.1f Các tương tác HMBC chính của hợp chất EB-1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để xác định cấu hình tuyệt đối của C-2 trong phân từ hợp chất EB-1 chúng tôi
đã tiến hành ghi phổ CD của EB-1. Phổ CD của hợp chất EB-1 cho thấy hiệu ứng cotton xung quanh 319 nm (Hình 4.1g), tương tự như hợp chất (2S)-5-hydroxy-6,8- dimethoxy-2-methyl-4H-2,3-dihydronaphtho[2,3-b]-pyran-4-one, điều này gợi ý cấu hình ở C-2 của EB-1 là cấu hình S. 200 250 300 350 400 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 1 Wavelength (nm) M ol ar E ll ip ti ci ty [θθθθ ]×××× 1 0 3 Hình 4.1g Phổ CD của hợp chất EB-1
Thêm vào đó để khẳng định thêm cấu hình của EB-1, chúng tôi đã xác định cấu hình aglycone EB-1a bằng cách so sánh độ quay cực của EB-1a với hợp chất 2- methylchroman-4-one và hợp chất (R)-dihydroeleutherinol ([α]25D = + 8,8) [95]. Độ
dihydroxy-2-methylchroman-4-one có độ quay cực là [α]D= – 58,6 và hợp chất (R) 7-methoxy-2-methylchroman-4-one có độ quay cực là [α]D= + 53,2 [115]. Điều này xác nhận hợp chất EB-1a có cấu hình ở C-2 là S. Do vậy, hợp chất EB-1được xác
định là (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside. Đây là hợp chất mới lần
đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên.
O O Me Me OH O EB -1 O OH HO HO HO Hình 4.1h Cấu trúc của hợp chất EB-1 Hợp chất EB-2 (2)
Hợp chất EB-2 thu được dưới dạng bột, màu trắng. Phổ khối lượng của hợp chất EB-2 cho pic ion phân tử [M+H]+ tại m/z 257 tương ứng với công thức phân tử
C15H12O4. Phổ UV hấp thụ các bước sóng cực đại tại λmax = 249, 270, 230 nm.