Định tính trên thiết bị phổ khối hiện đại: ESI MS Iontrap, thiết bị ESI MS
Orbitrap, và thiết bị FT ICR MS
- Tiến hành tiêm trực tiếp dịch thu được từ chiết pha rắn vào detector khối phổ, lựa chọn chế độ quét toàn thang để xác định mảnh mẹ đặc trưng m/z = 320, lựa chọn chếđộ SRM để xác định các mảnh con đặc trưng phân mảnh từ mảnh mẹ m/z = 320 với các chếđộ bắn phá (collision energy) khác nhau
Định tính và định lượng trên thiết bị khối phổ kiểu 3 tứ cực nối tiếp (triple
quadrupoles)
Tối ưu hóa điều kiện khối phổđối với TTX
Pha dung dịch TTX 10µg/ml trong MeOH, bơm trực tiếp vào máy khối phổ qua syringe chuẩn (Unimetrics 500 µL) với tốc độ 5µL/phút.
+ Gọi phương pháp Tune Plusđể xác định điều kiện khối phổ, chọn chếđộ Positive ESI (+ESI), chạy Automatic Tune để tối ưu hoá điều kiện phân mảnh.
Bước 1: Bật máy khối phổ, khởi động phần mềm và gọi phương pháp bằng cách: trên cửa sổInstrument Setup, chọn biểu tượng máy khối phổ LCQ Advantage Max MS sẽ xuất hiện hình máy khối phổ.
Bước 2: Nhắp chuột vào Tune Plus, xuất hiện cửa sổ Tune Plus, chọn chế độ Positive ESI (+ESI).
Bước 3: Bơm dung dịch TTX vào hệ thống khối phổ với tốc độ dòng 5 µL/phút, sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh ion có m/z = 320.
Bước 4: Nhấp vào biểu tượng Tune trên màn hình sẽ xuất hiện cửa sổ chạy chếđộ Automatic Tune.
Bước 5: Trong ô Mass (m/z), đánh số 320 để Tune cho mảnh 320, và chọn lựa bắn phá mảnh mẹ m/z = 320 thành 4 mảnh con. Máy sẽ tựđộng điều chỉnh và tối ưu hoá các thông số sao cho bắt mảnh ion mẹ m/z = 320 cùng với các mảnh con tương ứng tốt và nhạy nhất. Quá trình này mất khoảng 5 phút. Sau khi máy đã tự động điều chỉnh, đưa ra điều kiện phù hợp để tín hiệu của mảnh ion mẹ m/z 320 tốt hơn và điều kiện để có các mảnh con tối ưu. Lưu file Tune lại đặt tên là Tune_TTX_320- 4_products_ion. LCQTune
Thiết lập phương pháp LC-MS cho TTX
Ở phần Instrument Setup, gọi file Tune_TTX_320-4_products_ion. LCQTune. Chọn phân tích MS 2 lần (MS/MS), chếđộ SRM, lựa chọn phân mảnh m/z = 320 về mảnh con đặc trưng có tín hiệu tối ưu.
Thiết lập các điều kiện khối phổ: Nguồn ion hóa (+ESI), khí thổi (SG), khí bổ trợ (AG), nhiệt độ hóa hơi, nhiệt độ mao quản, thế ion hóa.
Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) đểđịnh lượng TTX
Khảo sát để tìm điều kiện sắc ký như: - Cột sắc ký: cột C3, C8
- Pha động: thay đổi tỷ lệ pha động để lựa chọn tỷ lệ phù hợp
- Tốc độ dòng: điều chỉnh tốc độ dòng để thời gian lưu phù hợp, đảm bảo mức áp suất qua cột.
- Điều kiện khối phổ cho chương trình sắc ký LC-MS định lượng TTX:
(Nguồn ion hóa (+ESI), khí thổi Sheath Gas (SG), khí bổ trợ Auxiliary Gas (AG), nhiệt độ hóa hơi, nhiệt độ mao quản, thế ion hóa) để tín hiệu thu được tốt, đảm bảo độ nhạy, độổn định trong quá trình định lượng
Đánh giá phương pháp
- Độđặc hiệu: Được tiến hành so sánh tương ứng giữa mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử
- Độ thích hợp hệ thống: Xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện
tích pic cùng mẫu chuẩn tiêm 6 lần
- Độ tuyến tính. Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi qui giữa diện tích
pic và nồng độ chất phân tích. Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng nồng độ phân tích để khảo sát, phân tích mẫu xác định phương trình hồi quy (y=ax+b) và hệ số tương quan r.
- Độ lặp lại. Độ lặp lại kết quả phân tích được đánh giá thông qua sai số tương đối của kết quả phân tích.
- Độđúng. Bằng phương pháp thêm chất chuẩn và định lượng để xác định khả
năng tìm lại.
- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ.
+ Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không cần thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu trắng. LOD là một thông số của phép thử giới hạn.
LOD=!"!
Trong đó: S: là độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu trắng
b : độ nhạy
+ Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thểđịnh lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận được. LOQ chấp nhận được nếu đạt các điều kiện: 1) đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng; 2) pic của chất cần phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp
ứng lặp lại với độ chính xác 20%. Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện.
Ngoài ra, giới hạn định lượng còn được xác định bằng nồng độ chất cho đáp ứng có tỉ số S/N = 10.