Chiết và làm giàu mẫu (dịch chiết toàn phần có chứa TTX)
Xử lý mẫu, ngâm, chiết và lọc: Phủ tạng cá nóc (trứng, gan, ruột, khoảng 10 kg)
được rã đông, cắt nhỏ, cho vào thùng chứa của thiết bị xay ngâm chiết. Thêm một lượng nước khoảng (20 L), thêm khoảng 50 ml dung dịch acid acetic 10 %. Khởi động hệ thống cánh khuấy của thiết bị, khuấy trong vòng 4 – 8 tiếng (hoặc qua đêm). Khởi động phần thiết bị xay thô, mở van để chuyển toàn lượng dịch và cá xuống phần xay thô, mẫu được nghiền và xay nát qua lưới, được chuyển tiếp xuống phần xay mịn, và được lọc qua lưới vào thùng đựng dung tích 100 L. Chuyển 15 L nước và 50 ml dung dịch acid acetic 10 % vào thùng khuấy, mở van và khởi động máy xay. Thực hiện bước này thêm 1 lần nữa để chiết được tối đa độc tố. Phần bã cá nóc còn lại được xử lý theo quy định. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào thiết bị cất quay dung tích 200 L, điều chỉnh để dịch ngâm được ngâm ở nhiệt độ 85 – 90oC, để làm kết tủa và loại bỏ protein hòa tan.
Sắc ký trao đổi ion thu dịch chiết toàn phần TTX: Điều chỉnh dịch ngâm về tới pH
6,0 – 7,0 bằng dung dịch NaOH 0,1 M, cho dịch chạy qua cột trao đổi cation acid
yếu (nhựa Amberlit IRC-60) để làm giàu độc tố. Rửa giải TTX bằng acid acetic 3 %.
Điều chỉnh dịch rửa giải về pH 8-9 bằng NaOH 0,1 M, cho dịch lọc qua cột nhồi hỗn hợp than hoạt và diatomis (silica diatomaceous) để loại muối vô cơ muối acid amin kiềm. Rửa cột bằng nước khử ion, sau đó rửa giải với dung dịch acid acetic 2% trong ethanol.
Tinh chế bằng kết tinh cho sản phẩm TTX thô.
Dịch rửa giải thu được được điều chỉnh đến pH kiềm (pH 9,0) bằng ammoniac đặc,
làm lạnh, để yên kết tinh TTX, lọc, sấy dưới áp suất giảm đến khối lượng không đổi (khoảng 24 giờ). Định lượng TTX thô bằng phương pháp LC-MS. Yêu cầu TTX thô chiết xuất qua giai đoạn này phải có hàm lượng ≥ 80%.
Nếu sản phẩm không đạt hàm lượng theo yêu cầu, cần phải tiến hành sơ tinh chế.
Quy trình sơ tinh chế.
Hòa tan lại tủa TTX trong dung dịch acid acetic 1%, trung hòa dung dịch bằng dung
dịch ammoniac 10 % đến pH kiềm, tiếp tục làm lạnh để kết tinh TTX. Rửa tủa kết
tinh bằng nước khử ion vài lần và sấy tủa trong tủ sấy áp suất giảm thu được tinh thể TTX.
Tinh chế TTX thô bằng sắc kýđiều chếđể thu được TTX có độ tinh khiết cao
Chương trình sắc ký tinh chế TTX từ sản phẩm TTX thô: Cột sắc ký bán điều chế:
ODS (HIQ Sil, 250 x 21,2 mm, 5µm hoặc 10 µm); Pha động: Dung dịch natri
heptansulfonat 0,01 M; Tốc độ dòng: 4 ml/phút; thể tích tiêm: 200 µl, detector UV
bước sóng 201 nm
TTX thô được hòa tan trong dung dịch acid acetic 1 % nồng độ khoảng 20 mg/ml.
Tiêm mỗi lần 200 µl, thu phân đoạn pic TTX tinh khiết. Gộp các tất cả các phân đoạn TTX thu được và cô quay dưới áp suất giảm. Làm lạnh dịch, thêm dung dịch
amoiac đậm đặc để kết tinh TTX, lọc tủa kết tinh, rửa tủa kết tinh bằng nước khử
ion đến khi hết phản ứng Na+ (dùng đũa thủy tinh, đốt dịch rửa dưới ngọn lửa). Hòa tan lại tủa TTX trong dung dịch acid acetic 1%, trung hòa dung dịch bằng dung dịch
ammoniac 10 % đến pH kiềm, tiếp tục làm lạnh để kết tinh TTX. Rửa tủa kết tinh
bằng nước khử ion vài lần và sấy tủa trong tủ sấy áp suất giảm thu được tinh thể
TTX tinh khiết.
Phân tích xác định cấu trúc: TTX tinh khiết được nhận dạng bằng đo phổ NMR
(1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, COSY) và HR FTICR MS.
Định tính và định lượng tetrodotoxin: hàm lượng tetrodotoxin trong sản phẩm
