Dùng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm dựa trên mặt hợp tử tại tâm rút gọn, kết quả được xử lý bằng phần mềm FormRules v2.0, INForm v3.1 để tìm ra mối quan hệ giữa các biến độc lập và các biến phụ thuộc.
3.3.1Thiết kế thí nghiệm
39
Bảng 3.12 Bảng ký hiệu và mức cần đạt đƣợc của các biến đầu ra
STT Biến Ký hiệu Đơn vị Mục tiêu
1 Hàm lượng netilmicin còn lại
Y1 % Max
2 ΔpH Y2 Min
3.3.1.2 Lựa chọn biến đầu vào
Từ các đánh giá sơ bộ ở trên, các biến đầu vào được lựa chọn trong bảng 3.13.
Bảng 3.13 Bảng ký hiệu và yêu cầu của các biến đầu vào
STT Biến Ký
hiệu
Đơn vị
Loại biến Giới hạn
1 Natri bisulfit X1 % Định lượng 0,2 đến 1
2 pH X2 Định lượng 4 đến 5
3 Dinatri edetat X3 % Định lượng 0,01 đến 0,05
4 Acid citric X4 % Định lượng 1 đến 2
3.3.1.3 Thiết kế thí nghiệm
Thiết kế mặt hợp tử tại tâm nhờ phần mềm MODDE 8.0 thu được bảng thiết kế thí nghiệm gồm 11 thí nghiệm trong đó có 3 thí nghiệm trung tâm được thể hiện ở bảng 3.14
40 Bảng 3.14 Bảng thiết kế thí nghiệm ST T Mẫu Natribisulfit (%) pH EDTA (%) Acid citric (%) 1 N1 0,2 4 0,01 1 2 N2 1 4 0,01 2 3 N3 0,2 5 0,01 2 4 N4 1 5 0,01 1 5 N5 0,2 4 0,05 2 6 N6 1 4 0,05 1 7 N7 0,2 5 0,05 1 8 N8 1 5 0,05 2 9 N9 0,6 4,5 0,03 1,5 10 N10 0,6 4,5 0,03 1,5 11 N11 0,6 4,5 0,03 1,5 3.3.2 Tiến hành thí nghiệm
Pha các mẫu thuốc tiêm theo công thức và thứ tự trong bảng thiết kế thí nghiệm trên. Mỗi mẫu pha 10 ml, đóng lọ thủy tinh không màu, đậy nút cao su, siết nắp nhôm. Các mẫu sau đó được đem đi luộc sôi ở 1000C trong 30 phút. Đo sự thay đổi hàm lượng và pH của các mẫu sau khi lão hóa cưỡng bức thu được kết quả như trong bảng 3.15
Bảng 3.15 Kết quả thực nghiệm giá trị các biến đầu ra (n=1) STT Mẫu ΔpH Hàm lƣợng netilmicin còn lại (%)
1 N1 0,21 96,30
2 N2 0,16 81,40
3 N3 0,26 86,04
4 N4 0,38 95,14
41
STT Mẫu ΔpH Hàm lƣợng netilmicin còn lại (%)
6 N6 0,35 93,10 7 N7 0,33 97,50 8 N8 0,24 95,40 9 N9 0,21 95,12 10 N10 0,24 97,30 11 N11 0,22 99,00
3.3.3 Ảnh hưởng của các biến đầu vào đến các biến đầu ra
Dùng phần mềm INForm v3.1 để xử lý số liệu của các biến đầu vào và biến đầu ra thu được kết quả trong bảng 3.16
Bảng 3.16 Kết quả luyện bảng neuron nhân tạo Biến phụ thuộc Số đơn vị đầu vào Số đơn vị đầu ra Số đơn vị ẩn Số lần luyện R 2 luyện Y1 4 1 1 10000 95,2388 Y2 4 1 1 10000 86,798 Nhận xét:
Kết quả xử lý cho thấy R2 luyện của các biến đều lớn hơn 80% chứng tỏ quan hệ giữa biến độc lập và biến phụ thuộc được mô tả chính xác bằng mạng neuron nhân tạo.Phân tích ảnh hưởng của các biến độc lập đến các biến phụ thuộc bằng phần mềm FormRules v2.0 cho kết quả thể hiện trong bảng 3.17
42
Bảng 3.17 Ảnh hƣởng của biến độc lập đến biến phụ thuộc Biến phụ thuộc Biến độc lập Y1 Y2 X1 + + X2 + + X3 + + X4 + +
Ghi chú ―+‖: có ảnh hưởng; ―-‖ : không ảnh hưởng
Mặt đáp 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7 thể hiện rõ hơn ảnh hưởng của biến độc lập đến biến phụ thuộc.
Hình 3.3 Mặt đáp của hàm lượng netilmicin theo nồng độ natribisulfit và pH khi cố định nồng độ dinatri edetat là 0,05 %, acid citric là 2%
Nhận xét:
Ảnh hưởng của pH: Khi pH tăng từ 4 đến 4,4 hàm lượng netilmicin còn lại giảm dần. Khi pH tăng từ 4,5 đến 5 thì hàm lượng netilmicin còn lại lại tăng dần.
(%)
43
Ảnh hưởng của natribisulfit: Ở pH khoảng 4,4 – 4,6 hàm lượng natri bisulfit càng cao thì hàm lượng netilmicin còn lại càng cao. Còn khoảng pH từ 4,0 – 4,4 và 4,6 – 5,0 hàm lượng natribisulfit càng nhỏ thì hàm lượng netilmicin còn lại càng cao.
Hình 3.4 Mặt đáp của hàm lượng netilmicin theo nồng độ natribisulfit và dinatri edetat khi cố định pH = 4,5 và acid citric là 1,5 %
Hình 3.5 Mặt đáp hàm lượng netilmicin theo nồng độ natribisulfit và đệm khi cố định pH = 4,5 và dinatri edetat = 0,03% (%) (%) (%) (%) (%) (%)
44
Nhận xét:
Nồng độ đệm càng cao hàm lượng netilmicin càng giảm. Nồng độ natribisulfit càng cao hàm lượng netilmicin càng giảm (hình 3.5). Nồng độ dinatriedetat càng cao thì hàm lượng netilmicin còn lại càng cao (hình 3.4). Điều này có thể giải thích là do trong natri bisulfit có chứa các tạp chất (kim loại nặng, gốc tự do…) dẫn đến sử dụng nhiều chất chống oxy hóa không làm tăng độ ổn định mà lại làm giảm độ ổn định của dung dịch netilmicin sulfat do làm gia tăng tạp chất vào dung dịch. Trong khi đó dinatri edetat có tác dụng chống oxy hóa bằng cách tạo phức với các ion kim loại nặng . Do đó nồng dinatri edetat càng tăng thì dung dịch netilmicin càng ổn định.
Hình 3.6 Mặt đáp biến thiên pH theo pH và nồng độ đệm khi cố định nồng độ natribisulfit là 0,6% và dinatri edetat là 0,03%
Nhận xét:
pH dung dịch càng nhỏ thì biến thiên pH của dung dịch càng nhỏ. Điều này có thể giải thích là do netilmicin sulfat ổn định ở pH thấp nên pH dung dịch càng nhỏ, netilmicin sulfat càng ổn định, hạn chế phân hủy dược chất ra các tạp chất. Do đó biến thiên pH càng nhỏ. Nồng độ đệm citric/citrrat càng cao thì biến thiên pH càng nhỏ. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với lý
45
thuyết khi dung lượng đệm càng cao thì khả năng đệm càng lớn và do đó độ biến thiên pH của dung dịch càng nhỏ.
Hình 3.7 Mặt đáp biểu diễn biến thiên pH theo nồng độ natribisulfit và đệm citrat khi cố định nồng độ dinatri edetat 0,03 % và pH là 4,5.
Nhận xét: Hàm lượng natribisulfit càng cao thì biến thiên pH càng nhỏ. Điều này có thể giải thích là do hàm lượng natribisulfit càng cao thì càng làm tăng độ ổn định của netilmicin sulfat, hạn chế sự phân hủy của dược chất thành các tạp chất liên quan. Do đó ít ảnh hưởng đến pH của dung dịch.
3.3.4 Lựa chọn công thức tối ưu
Từ kết quả 11 thí nghiệm sử dụng phương pháp tối ưu hóa bằng phần mềm INForm v3.1 tối ưu được các biến đầu vào như sau:
Bảng 3.18 Giá trị tối ƣu cho các biến đầu vào trong xây dựng công thức thuốc tiêm netilmicin sulfat
STT Biến đầu vào Giá trị tối ƣu
1 Natribisulfit (%) 0,25
2 pH 4,75
3 NaEDTA (%) 0,05
4 Acid citric (%) 1,54
46
Do netilmicin sulfat rất nhạy cảm với nhiệt nên không sử dụng phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt được nên chúng tôi sử dụng phương pháp lọc tiệt khuẩn kết hợp với sử dụng chất sát khuẩn trong công thức. Như vậy công thức thuốc tiêm netilmicin sulfat được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu có thành phần như sau:
Bảng 3.19 Công thức tối ƣu hóa.
STT Thành phần % (khối lƣợng/thể tích) 1 Netilmicin sulfat 14,41 2 Natribisulfit 0,25 3 Dinatri edetat 0,05 4 Acid citric 1,54 5 NaOH, H2SO4 vừa đủ pH 4,75 6 Nipagin 0,18 7 Nipasol 0,02
8 Nước cất pha tiêm vừa
đủ 100 ml
3.4 Theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm pha theo công thức tối ƣu
Tiến hành pha chế 200 ml thuốc tiêm theo sơ đồ hình 2.1, đóng ống thủy tinh 2 ml màu hổ phách, sục nitrogen trong quá trình đóng ống.
Theo dõi mẫu trong 2 điều kiện: - Nhiệt độ phòng tránh ánh sáng. - Trong tủ vi khí hậu (40 ± 2oC).
Tại các thời điểm khác nhau, lấy mẫu quan sát cảm quan và định lượng hàm lượng netilmicin còn lại và đo pH dung dịch thu được kết quả trong bảng 3.20.
47
Bảng 3.20 Kết quả theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm netilmicin sulfat Thời gian (tuần) Nhiệt độ phòng 40oC Độ vô khuẩn Hàm lƣợng còn lại (%) ΔpH Hàm lƣợng còn lại (%) ΔpH 0 100 0 100 0 Vô khuẩn 2 98,84 -0,18 97,61% -0,25 4 97,3 -0,14 96,30 -0,14 6 95,67 -0,24 94,63 -0,17 8 94,78 -0,18 95,36 -0,24 10 96,49 -0,26 97,17 -0,28 Nhận xét:
Sau thời gian bảo quản 10 tuần ở các điều kiện khác nhau, thuốc tiêm pha theo công thức tối ưu đều ổn định về mặt hình thức, hàm lượng netilmicin sulfat còn lại đều trên 90%, pH dung dịch nằm trong khoảng pH đã khảo sát. Nhiệt độ có ảnh hưởng rõ ràng đến độ ổn định của netilmicin sulfat.
Tuy nhiên đây mới chỉ là những kết quả ban đầu, cần tiếp tục theo dõi thêm để xác định tuổi thọ của thuốc.
3.5 Dự đoán tuổi thọ của thuốc
Dựa trên kết quả nghiên cứu độ ổn định của thuốc tiêm netilmicin sulfat, bằng phương pháp lão hóa cấp tốc, xử lý số liệu để dự đoán tuổi thọ của thuốc tiêm.Kết quả được thể hiện ở bảng 3.21
Nhận xét:
Ở cả điều kiện thưởng và điều kiện lão hóa cấp tốc nhiệt độ 40oC phương tình hồi quy tuyến tính có bình phương hệ số tương quan R2 đều rất nhỏ, không có giá trị thống kê. Do đó không nên sử dụng hệ số nhiệt để dự đoán tuổi thọ của thuốc tiêm netilmicin sulfat.
48
Bảng 3.21 Phƣơng trình hồi qui tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lƣợng netilmicin sulfat còn lại (C) và thời gian bảo quản (t)
Nhiệt độ Bậc phản ứng Phƣơng trình hồi quy tuyến tính R2
Điều kiện thường Bậc 0 C = -0,448t + 99,42 0,7303 Bậc 1 lnC = - 0,0046.t + 4,5994 0,7276 Bậc 2 1/C = 5.10-5.t + 0,0101 0,7249 40oC Bậc 0 C = -0,3224t + 98,457 0,4013 Bậc 1 lnC = -0,0033.t + 4,5895 0,3998 Bậc 2 1/C = 3.10-5.t + 0,0102 0,3964
49
Chƣơng 4. BÀN LUẬN 4.1 Về phƣơng pháp định lƣợng
Phương pháp HPLC với các thông số đã khảo sát đạt tính thích hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại. Do vậy có thể ứng dụng phương pháp này vào thực tế để định lượng netilmicin sulfat. So với phương pháp trong dược điển Mỹ 37 (pha động bao gồm natri heptansulfonat, acid phosphoric, acetonitril) thì phương pháp này rẻ tiền hơn. So với phương pháp định lượng netilmicin bằng phương pháp vi sinh thì phương pháp này chính xác hơn và dễ thực hiện hơn. Tuy nhiên độ phân giải của pic vẫn chưa thực sự tốt, pic vẫn còn kéo đuôi.
4.2 Về xây dựng công thức bào chế thuốc tiêm netilmicin sulfat
Công thức bào chế được xây dựng trong đề tài nghiên cứu này so với các công trình nghiên cứu trước đây có những điểm giống và khác nhau:
Về lựa chọn chất chống oxy hóa:
Các tài liệu trước đây lựa chọn chất chống oxy hóa là natrisulfit [15], [20], [25]. Tuy nhiên qua khảo sát thực tế trong đề tài thì natribisulfit là chất chống oxy hóa có tác dụng tốt hơn và giúp ổn định dược chất hơn.Natri bisulfit cũng là chất chống oxy hóa được lựa chọn trong nghiên cứu của Phạm Thị Ánh Tuyết và Trần Thị Minh Thu giúp tăng độ ổn định của tobramycin, một kháng sinh có cấu trúc gần giống với netilmicin.
Nồng độ chất chống oxy hóa trong nghiên cứu này lựa chọn là 0,25%, thấp hơn so với các nghiên cứu trước đây[20], [25]. Tuy nhiên nếu sử dụng nồng độ natri bisulfit quá cao (>1%) sẽ gây lo ngại về vấn đề dị ứng.Đồng thời phương pháp tiệt khuẩn lựa chọn trong nghiên cứu này là phương pháp lọc tiệt khuẩn nên nồng độ chất chống oxy hóa sẽ thấp hơn so với công thức sử dụng phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt.Trong công thức cũng sử dụng chất hiệp đồng chống oxy hóa là dinatri edetat, điều này phù hợp với các công trình nghiên cứu trước đây.
50
Về lựa chọn pH và hệ đệm:Nghiên cứu đã chỉ ra ảnh hưởng của pH và hệ đệm đến độ ổn định của netimicin. Kết quả cho thấy netilmicin ổn định ở pH thấp, điều này có thể giải thích là do netilmicin tồn tại dưới dạng muối sulfat nên ổn định ở pH thấp. pH lựa chọn trong nghiên cứu này và các nghiên cứu trước đây có khác nhau nhưng vẫn nằm trong khoảng yêu cầu của dược điển Mỹ 37 (3,5 – 6,0). Tuy nhiên nghiên cứu này có sử dụng hệ đệmcitrat đểtăng độ ổn định của dược chất. Điều này có thể giải thích là do độ ổn định của netilmicin nhạy cảm với pH nên sử dụng hệ đệm sẽ giúp ổn định pH. Ngoài ra hệ đệm citrat còn hiệp đồng chống oxy hóa do có khả năng tạo phức với ion kim loại.
Về quy trình bào chế: Nghiên cứu này có kết quả giống với các nghiên cứu trước khi chỉ ra rằng, nhiệt độ ảnh hưởng mạnh đến độ ổn định của dung dịch netilmicin sulfat[26]. Do đó phương pháp tiệt khuẩn thuốc tiêm được sử dụng là lọc tiệt khuẩn kết hợp với dùng chất sát khuẩn. Trong quá trìnhpha chế và đóng ống thuốc tiêm phải sục khí nitrogen.
Sau khi xây dựng được quy trình bào chế và pha chế với quy mô nhỏ, nghiên cứu đã tiến hành thử độ vô khuẩn của chế phẩm và kết quả chế phẩm đạt độ vô khuẩn.
4.3 Về theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm netilmicin sulfat pha chế theo công thức tối ƣu công thức tối ƣu
Nghiên cứu đã tiến hành theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm netilmcin sulfat về các tiêu chí: hàm lượng netilmicin còn lại và biến thiên pH được 10 tuần với 2 điều kiện: điều kiện thường và điều kiện lão hóa cấp tốc 40 ± 2oC. Kết quả cho thấy trong thời gian theo dõi dung dịch thuốc tiêm trong suốt, không màu, đạt yêu cầu về hàm lượng dược chất (>90%), pH nằm trong khoảng cho phép. Tuy nhiên thời điểm ban đầu từ 0 đến 2 tuần biến thiên pH lớn (- 0,18 với mẫu bảo quản ở điều kiện thường và – 0,25 đối với mẫu bảo quản ở điều kiện 40oC). Nhưng thời điểm từ 2 tuần đến 4, 6,8, 10 tuần thì biến
51
thiên pH thay đối ít.Điều này có thể giải thích bởi 2 nguyên nhân. Nguyên nhân thứ nhất là thời điểm ban đầu hệ chưa ổn định nên pH biến đổi mạnh, giai đoạn sau hệ ổn định hơn nên pH biến đổi ít. Nguyên nhân thứ 2 là do sai số máy móc (thời điểm 0 tuần và 2 tuần đo mẫu bằng 2 máy đo pH khác nhau).
Mẫu bảo quản trong điều kiện lão hóa cấp tốc 40 ± 2oC hàm lượng netilmicin sulfat còn lại thấp hơn so với mẫu bảo quản ở điều kiện thường. Điều này phù hợp với lý thuyết và kết quả phần khảo sát vì netilmicin không bền khi tiếp xúc với nhiệt độ.
Quá trình pha chế thuốc tiêm với quy mô nhỏ100 ống 2 ml trong điều kiện pha chế không kiểm soát cấp độ sạch nhưng có sử dụng chất sát khuẩn trong công thức và lọc tiệt khuẩn nên mẫu thuốc tiêm vẫn đạt tiêu chí độ vô khuẩn (phụ lục 4). Tuy nhiên cần đánh giá thêm chỉ tiêu chí nhiệt tố.
52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Từ các kết quả thực nghiệm chúng tôi rút ra được một số kết luận sau: 1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến độ ổn định của thuốc tiêm netilmicin a. Yếu tố thuộc về công thức thuốc
Qua khảo sát các chất chống oxy hóa khác nhau (natri metabisulfit, natri bisulfit, natri sulfit, Rongalite) chất chống oxy hóa tốt nhất là natri bisulfit. Công thức có sử dụng thêm chất hiệp đồng oxy hóa là dinatri edetat ổn định hơn công thức chỉ sử dụng chất chống oxy hóa.
Độ ổn định của netilmicin sulfat nhạy cảm với pH và ổn định ở pH thấp. Để giúp ổn định dược chất cũng như ổn định pH của thuốc tiêm cần sử dụng hệ đệm.Hệ đệm nên sử dụng là đệm citric/citrat.
Bao bì đóng ống thuốc tiêm là ống thủy tinh màu. b. Yếu tố về kỹ thuật bào chế
Netilmicin rất dễ phân hủy bởi nhiệt độ và bị ảnh hưởng bởi ánh sáng nên không sử dụng phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt được. Trong quá trình pha chế và đóng ống cần sục khí nitrogen.
c. Yếu tố thuộc về điều kiện bảo quản
Bảo quản thuốc tiêm ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. 2. Xây dựng công thức thuốc tiêm netilmicin sulfat tối ưu.
Thành phần cho 1 ống thuốc tiêm netilmicin sulfat 2 ml bao gồm:
Netilmicin sulfat 288,2 mg Natribisulfit 5 mg NaEDTA 1 mg Acid citric 30,8 mg Nipagin 3,6 mg Nipasol 0,4 mg