Mẫu nghiên cứu
Thuốc tiêm pha theo công thức tối ưu, đóng ống thủy tinh màu hổ phách và theo dõi độ ổn định trong các điều kiện bảo quản khác nhau.
Điều kiện bảo quản:
- Điều kiện thực: nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
- Điều kiện lão hóa cấp tốc: Trong tủ vi khí hậu duy trì nhiệt độ 40 ± 2o
C. Phương pháp phân tích:
Đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm nghiên cứu dựa trên các tiêu chí sau: - Tính chất: Độ trong và màu sắc dung dịch.
- pH dung dịch: xác định pH của dung dịch sau khi pha chế và dung dịch sau thời gian bảo quản bằng máy đo pH.
- Hàm lượng dược chất: xác định hàm lượng dược chất trong dung dịch mới pha (coi hàm lượng ban đầu là 100%), hàm lượng dược chất còn lại (%)
25
trong các mẫu nghiên cứu sau thời gian bảo quản được xác định theo công thức:
X ó
đ x 100% X: hàm lượng dược chất còn lại (%).
đ : hàm lượng dược chất khi mới pha chế. ó : hàm lượng dược chất sau thời gian bảo quản.
26
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng thuốc tiêm netilmicin
3.1.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ netilmicin khoảng 1 mg/ml như sau: Cân chính xác khoảng 0,072g netilmicin sulfat hòa tan vào bình định mức 50ml bằng hỗn hợp dung môi nước – acetonitril (tỷ lệ 1:1). Lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc 0,45 µm.
Tiêm mẫu 6 lần qua cột sắc ký với các điều kiện ghi như ở mục 2.3.2.1 kết quả diện tích pic (Spic), thời gian lưu (tR) được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Bảng kết quả kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký STT tR (phút) Spic (mAU.s) 1 1,373 5906,6 2 1,371 5994,7 3 1,372 5918,9 4 1,372 6029,7 5 1,370 6030,2 6 1,374 5963,7 ̅ 1,372 5974,0 SD 0,001414 53,6 RSD (%) 0,1031 0,8975
27
Nhận xét:
Điều kiện HPLC cho độ lặp lại tốt về thời gian lưu, diện tích pic với độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2%, do vậy hệ thống sắc ký trên đảm bảo được tính thích hợp với quy trình định lượng netilmicin sulfat trong chế phẩm thuốc.
3.1.2. Thẩm định quy trình định lượng
3.1.2.1 Tính đặc hiệu
Pha dung dịch mẫu chuẩn có hàm lượng netilmicin khoảng 1 mg/ml như trên.
Pha dung dịch như sau: Hút chính xác 1 ml dung dịch mẫu thử vào bình định mức 10ml, bổ sung hỗn hợp dung môi nước – acetonitril (tỷ lệ 1:1) vừa đủ. Tiếp tục pha loãng dung dịch này 10 lần bằng hỗn hợp dung môi trên sẽ được dung dịch thử có nồng độ khoảng 1mg/ml.
Mẫu trắng: Hồn hợp dung môi nước – acetonitril tỷ lệ 1:1.
Định lượng các dung dịch này bằng phương pháp HPLC thu được sắc ký đồ của, mẫu chuẩn, mẫu thử.mẫu trắng (chỉ có dung môi) (phụ lục 1)
Kết quả:
Đối với mẫu chuẩn và mẫu thử, sắc ký đồ cho một pic cân xứng với thời gian lưu khoảng 1,37 phút, đó là pic của netilmicin (phụ lục 1, 2)
Đối với mẫu trắng, trên sắc ký đồ không có pic nào xuất hiện trong khoảng thời gian lưu của netilmicin.
Nhận xét: Phương pháp có tính đặc hiệu cao, dược chất netilmicin có một pic với thời gian lưu khoảng 1,37 phút.
3.1.2.2 Tính tuyến tính
Pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ netilmicin lần lượt là 0,25; 0,50; 0,75; 1,00; 1,25; 1,50 mg/ml. Tiến hành sắc ký các dung dịch này bằng phương pháp HPLC như ở mục 2.3.2.1 , kết quả diện tích pic được thể hiện trong bảng 3.2 :
28
Bảng 3.2 Mối tƣơng quan giữa nồng độ netilmicin và diện tích pic. STT Nồng độ (mg/ml) Spic (mAu.s) 1 0,25 1513,6 2 0,50 3128,0 3 0,75 4638,8 4 1,00 6058,5 5 1,25 7517,5 6 1,50 9135,6
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ netilmicin và Spic . Nhận xét:
Kết quả trên cho thấy giữa diện tích pic và nồng độ netilmicin có sự phụ thuộc tuyến tính với nhau trong khoảng nồng độ từ 0,25 đến 1,50 mg/ml với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1. y = 6022.6x + 62.196 R² = 0.9996 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 0 0.5 1 1.5 2 Diện tích pic ( m Au.s) Nồng độ(mg/ml)
29
3.1.2.3 Độ lặp lại
Định lượng 6 lần một mẫu thử nồng độ khoảng 1 mg/ml, mỗi lần định lượng 3 lần tiêm mẫu, lấy giá trị Spic trung bình thu được kết quả thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Bảng kiểm tra độ lặp lại của phƣơng pháp (n=1)
STT Spic (mAU.s) 1 6399,8 2 6390,5 3 6426,2 4 6273,2 5 6296,9 6 6269,3 ̅ 6342,7 SD 70,5 RSD (%) 1,1 Nhận xét:
Phương pháp cho độ lặp lại tốt với độ lệch chuẩn RSD < 2%.
3.1.2.4 Độ đúng
Dùng mẫu thử có nồng độ netilmicin đã xác định ở phần độ lặp lại, thêm vào một lượng chất chuẩn khoảng 80%, 100%, 120% nồng độ ghi trên nhãn, mỗi nồng độ thêm vào làm 3 lần.Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống HPLC với các điều kiện ghi ở mục 2.3.2.1, từ kết quả diện tích pic xác định hàm lượng
30
netilmicin, tính tỷ lệ phục hồi (% lượng chất chuẩn tìm thấy được sau khi thêm vào dung dịch thử). Kết quả được thể hiện trong bảng 3.4:
Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp. Tỷ lệ thêm chuẩn Hàm lƣợng mẫu (mg/ml) Lƣợng chất chuẩn thêm(mg/ml) Tỷ lệ phục hồi (%) Trung bình Thêm Tìm thấy 80% 0,43 0,40 0,397 99,33 98,80 0,43 0,40 0,392 98,01 0,43 0,40 0,396 99,05 100% 0,43 0,50 0,506 101,21 99,36 0,43 0,50 0,497 99,43 0,43 0,50 0,497 97,43 120% 0,43 0,50 0,601 100,2 99,45 0,43 0,50 0,601 100,2 0,43 0,50 0,588 98,00 Nhận xét:
Phương pháp cho độ lặp lại tốt RSD <2%. Kết quả thu được cho thấy tỷ lệ % tìm lại chất chuẩn đều nằm trong giới hạn cho phép (98 – 102%).
Kết luận: Phương pháp HPLC khảo sát đạt tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng. Do vậy có thể ứng dụng phương pháp này vào thực tế để định lượng netilmicin trong chế phẩm.
31
3.2 Đánh giá một số yếu tố ảnh hƣởng đến độ ổn định của thuốc tiêm netilmicin. netilmicin.
3.2.1 Ảnh hưởng của pH
Bào chế các mẫu dung dịch netilmicin 100 mg/ml ở các pH khác nhau: 3,00; 4,00; 5,00; 6,00, điều chỉnh pH bằng dung dịchnatri hydroxyd 1M hoặc acid sulfuric 1M, đóng lọ thủy tinh, siết nắp nhôm. Đánh giá màu sắc dung dịch ngay sau pha, sau luộc sôi 30 phút, sau bảo quản 1 tuần ở điều kiện thường. Kết quả được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.5 Ảnh hƣởng của pH đến màu sắc của dung dịch netilmicin pH Màu sau pha Màu sau luộc
sôi 30 phút
Màu sau bảo quản 1 tuần ở điều kiện thƣờng.
3,00 Không màu Vàng nhạt + Vàng ++ 4,00 Không màu Vàng +++ Vàng +++ 5,00 Vàng nhạt + Vàng ++++ Vàng ++++ 6,00 Vàng ++ Vàng +++++ Vàng +++++
Chú thích: dấu + thể hiện cường độ của màu vàng. Nhận xét:
Kết quả trên cho thấy độ ổn định của dung dịch thuốc tiêm netilmicin phụ thuộc nhiều vào pH dung dịch, pH của dung dịch càng thấp thì màu sắc của dung dịch càng ít biến đổi. Điều này có thể giải thích do netilmicin tồn tại ở dạng muối sulfat, ổn định ở khoảng pH thấp, không ổn định trong pH cao. Nếu pH quá thấp khi tiêm sẽ gây đau, do vậy pH 4 được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. Điều này cũng phù hợp với tiêu chuẩn thuốc tiêm netilmicin sulfat trong chuyên luận của USP 37 ( pH từ 3,5 đến 6,0)[28].
32
3.2.2 Ảnh hưởng của hệ đệm
Pha các dung dịch netilmicin 100 mg/ml có thành phần đệm và không có đệm citric-citrat 2% , điều chỉnh pH dung dịch về 4,0 bằng natri hydroxyd 1M hoặc acid sulfuric 1M, đóng lọ thủy tinh, siết nắp nhôm sau đó đánh giá màu sắc, ΔpH và hàm lượng còn lại của dung dịch sau luộc sôi 30 phút.
Bảng 3.6 Ảnh hƣởng của hệ đệm tới màu sắc, pH và hàm lƣợng của dung dịch netilmicinsulfat (n=3)
Loại đệm Màu sắc ΔpH Hàm lƣợng netilmicin còn lại (%)
Không đệm Vàng + 0,21 87,15
Đệm citrat 2% Vàng + -0,06 93,61
Chú thích: dấu + thể hiện cường độ của màu vàng. Nhận xét:
Khảo sát ảnh hưởng của hệ đến độ ổn định của dung dịch netilmicin sulfat nhận thấy mẫu có đệm và không có đệm màu sắc của dung dịch không có sự khác biệt lớn. Tuy nhiên, sự thay đổi pH, hàm lượng lại có sự khác biệt.Công thức sử dụng đệm citrat 2% ổn định hơn, biến thiên pH nhỏ hơn.Điều này có thể giải thích là do độ ổn định của netilmicin rất nhạy cảm với pH nên sử dụng hệ đệm sẽ giúp dược chất ổn định hơn. Ngoài ra, hệ đệm citrat được cho là có vai trò hiệp đồng chống oxy hóa do tạo phức với các ion kim loại nặng, thích hợp với những dược chất dễ bị oxy hóa như netilmicin. Do vậy đệm citrat 2% được lựa chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
33
3.2.3 Ảnh hưởng chất chống oxy hóa
3.2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ chất chống oxy hóa natri metabisulfit
Tham khảo tài liệu, natri metabisulfit là chất chống oxy hóa thích hợp với các thuốc tiêm có pH thấp. Do vậy, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất chống oxy hóa natri metabisulfit đối với độ ổn định của dung dịch netilmicin sulfat. Pha các dung dịch netilmicin sulfat với chất chống oxy hóa natri metabisulfit ở các nồng độ khác nhau 0; 0,5; 1; 2; 4%, điều chỉnh pH về 4, đóng lọ thủy tinh, siết nắp nhôm.Tiến hành đánh giá màu sắc, hàm lượng còn lại của các mẫu sau khi luộc sôi 30 phút. Kết quả thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.7 Ảnh hƣởng của nồng độ chất chống oxy hóa natri metabisulfit đối với độ ổn định của dung dịch netilmicin sulfat (n=3)
Nồng độ chất chống oxy hóa
(%)
Màu sắc Hàm lƣợng còn lại (%)
Sau pha Sau đun sôi 30 phút
0% Không màu Vàng +++ 93,12
0,5% Không màu Vàng ++ 92,41
1,0% Không màu Vàng + 94,50
2% Không màu Không màu 97,63
4% Không màu Không màu 101,10
Chú thích: dấu + thể hiện cường độ của màu vàng Nhận xét:
Kết quả cho thấy nồng độ chất chống oxy hóa càng cao, dung dịch netilmicin càng ổn định. Tuy nhiên nồng độ thường dùng của natri
34
metabisulfit từ 0,1- 1,0 %. Nếu dùng nồng độ cao hơn có thể gây lo ngại về vấn đề dị ứng. Do vậy nồng độ chất chống oxy hóa 1% được lựa chọn để tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố khác.
3.2.3.2 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa khác nhau đối với độ ổn định của dung dịch netilmicin
Pha các dung dịch thuốc tiêm netilmicin sulfat với các chất chống oxy hóa khác nhau: natri metabisulfit, natri sulfit, natri bisulfit, Rongalite…, theo bảng 3.8, điều chỉnh pH dung dịch về 4.Đóng các mẫu vào lọ thủy tinh, siết nắp nhôm.Sau đó đánh giá màu sắc, ΔpH, hàm lượng còn lại của dung dịch sau khi luộc sôi 30 phút. Kết quả khảo sát thể hiện trong bảng 3.8:
Chú thích: CT1- M1; CT2-M2; CT3-M3
Hình 3.2 Ảnh chụp các dung dịch netilmicin chứa các chất chống oxy hóa khác nhau
Nhận xét:
Kết quả trong bảng cho thấy, với cùng nồng độ chất chống oxy hóa 1%, sau khi đun sôi 30 phút chỉ có công thức chứa natri bisulfit là không bị biến màu, trong khi các công thức khác đều chuyển màu, đồng thời sự thay đổi pH cũng không quá lớn. Qua đó có thể kết luận, trong 4 chất chống oxy hóa, natri bisulfit là chất chống oxy hóa thích hợp nhất trong công thức dung dịch thuốc tiêm netilmicin sulfat.
35
Bảng 3.8 Ảnh hƣởng của chất chống oxy hóa đến độ ổn định của dung dịch netilmicin sulfat(n=3). STT Thành phần Khối lƣợng (g) CT1 CT2 CT3 CT4 1 Netilmicin sulfat 15,00 + + + + 2 Natri metabisulfit 1,00 - + - - 3 Natri sulfit 1,00 + - - - 4 Natri bisulfit 1,00 - - + - 5 Rongalite® 0,15 - - - + 6 Dinatri edetat 0,05 + + + + 7 Acid citric 2,00 + + + + 8 Natri hydroxyd 1M hoặc acid sulfuric 1M Vđ pH 4 + + + + 9 Nước cất pha tiêm Vđ 100 ml + + + + Màu sắc Vàng++ Vàng+ Trong Vàng++ ΔpH 0,1 -0,03 -0,06 - Hàm lƣợng (%) - - 92,82 -
Chú thích: (+) có hoặc thể hiện cường độ màu vàng ( -) không có hoặc không đánh giá
36
3.2.3.3 Ảnh hưởng của dinatri edetat.
Mặc dù sử dụng chất chống oxy hóa với nồng độ cao nhưng độ ổn định của dung dịch netilmicin sulfat còn thấp. Vì vậy để tăng độ ổn định của dược chất cần phải khảo sát thêm ảnh hưởng của chất hiệp đồng chống oxy hóa khác. Pha các dung dịch có thành phần như bảng 3.9.Đóng các mẫu vào lọ thủy tinh, siết nắp nhôm.Đánh giá màu sắc, hàm lượng còn lại của dung dịch netilmicin sau luộc sôi 30 phút.Kết quả thể hiện trong bảng 3.10.
Bảng 3.9Thành phần trong công thức khảo sát ảnh hƣởng của chất hiệp đồng chống oxy hóa. STT Thành phần Khối lƣợng (g) CT5 CT6 1 Netilmicin 15,00 + + 2 Natri bisulfit 1,00 + + 3 Acid citric 2,00 + + 4 Natri hydroxyd 1M hoặc acid sulfuric 1M
vđ pH=4 + +
5 Dinatri edetat 0,05 - +
6 Nước cất pha tiêm vđ 100 ml + +
Chú thích: + có, - không có
Bảng 3.10 Ảnh hƣởng của chất hiệp đồng chống oxy hóa đối với độ ổn định của dung dịch netilmicin sulfat (n=3)
Công thức
Màu sắc Hàm lƣợng còn
lại % Sau pha Sau luộc sôi 30 phút
CT5 Trong suốt Vàng + 87,9
CT6 Trong suốt Trong suốt 91,3
37
Nhận xét:
Kết quả trong bảng cho thấy dinatri edetat có ảnh hưởng đến độ ổn định dung dịch, sau đun sôi 30 phút, CT6 chứa dinatri edetatkhông bị biến màu, hàm lượng cao hơn. Điều này phù hợp với lý thuyết do phối hợp cả 2 cơ chế chống oxy hóa. Do vậy để tăng độ ổn định của dung dịch netilmicin sulfat, lựa chọn dinatri edetat 0,05% trong công thức bào chế. Tuy nhiên, độ ổn định dung dịch netilmicin vẫn chưa được đảm bảo ( hàm lượng dược chất còn lại vẫn thấp), do vậy cần khảo sát thêm các yếu tố khác làm tăng độ ổn định của dược chất.
3.2.4 Ảnh hưởng của quy trình bào chế tới độ ổn định của dung dịch.
3.2.4.1 Ảnh hưởng của sục khí nitrogen khi đóng ống.
Tiến hành đánh giá ảnh hưởng của điều kiện sục khí nitrogen đối với độ ổn định của dung dịch netilmicin. Pha dung dịch chứa netilmicin tại pH 4 theo CT6 trong bảng 3.9, đóng lọ thủy tinh rồi siết nắp nhôm với điều kiện không sục hoặc sục khí nitrogen trong 1, 2, 5 phút. Đánh giá độ ổn định sau luộc sôi 30 phút, kết quả được thể hiện trongbảng 3.11.
Bảng 3.11 Ảnh hƣởng của sục khí nitrogen khi đóng ống (n=3)
Thời gian sục Màu sắc
Sau pha Sau luộc sôi 30 phút
Không sục Không màu Vàng ++
Sục 1 phút Không màu Vàng +
Sục 2 phút Không màu Trong
Sục 5 phút Không màu Trong
38
Nhận xét:
Qua bảng trên, nhận thấy rõ ảnh hưởng của điều kiện sục nitrogen đến độ ổn định của dung dịch netilmicin. Sục nitrogen, giúp loại bỏ oxy – tác nhân chính gây oxy hóa netilmicin, làm giảm độ ổn định của dung dịch.Kết quả bảng 3.11 cho thấy, có sự khác biệt giữa các dung dịch có sục và không sục khí nitrogen, thời gian sục cũng ảnh hưởng, các dung dịch sục nitrogen trong 2 và 5 phút không có sự khác biệt. Vì vậy giai đoạn sục nitrogen là cần có trong quá trình bào chế dung dịch thuốc tiêm netilmicin và để đảm bảo hiệu quả cũng như tiết kiệm chi phí, thời gian sục được lựa chọn là 2 phút.
3.2.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện tiệt khuẩn bằng nhiệt.
Netilmicin là một dược chất dễ bị oxy hóa, tốc độ oxy hóa càng mạnh khi nhiệt độ tăng cao, vì vậy cần khảo sát ảnh hưởng của điều kiện tiệt khuẩn bằng nhiệt. Pha các dung dịch netilmicin theo CT6trong bảng 3.9, luộc sôi các mẫu trong 30 phút ở 100oC. Sau khi luộc sôi 30 phút ở 100oC, màu sắc của dung dịch không có sự biến đổi nhưng ΔpH thay đổi 0,04, đặc biệt hàm lượng netilmicin sulfat rất giảm chỉ còn 93,61%. Như vậy khi bào chế dung dịch thuốc tiêm netilmicin, không nên tiệt khuẩn bằng nhiệt mà nên sử dụng phương pháp lọc tiệt khuẩn.
3.3 Tối ƣu hóa công thức thuốc tiêm netilmicin
Dùng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm dựa trên mặt hợp tử tại tâm rút gọn, kết quả được xử lý bằng phần mềm FormRules v2.0, INForm v3.1 để tìm ra mối quan hệ giữa các biến độc lập và các biến phụ thuộc.
3.3.1Thiết kế thí nghiệm
39
Bảng 3.12 Bảng ký hiệu và mức cần đạt đƣợc của các biến đầu ra