4. Ý nghĩa của đề tài
3.2.2.1. Tối ưu hóa điều kiện PCR và khuếch đại gen 16S rRNA
Để nhân nhanh băng 16S rRNA của H. pylori, phản ứng PCR được tối ưu hóa bằng cách khảo sát nồng độ các thành phần như: Taq-polymerase; nồng độ dNTP; DNA khuôn; nhiệt độ bắt cặp và số chu kỳ của phản ứng. Vì các thành phần này có ảnh hưởng rõ rệt đến số băng vạch, độ đậm nét của băng và sự bám của mồi.
- Nồng độ Taq-polymerase (1U/µl) thay đổi từ 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1 µl, trong các phản ứng PCR có dNTP (10mM) 2,5; DNA khuôn (40x) 2,5; mồi (10 pmol) 1,25; buffer 10x 2,5; số chu kỳ 45. Kết quả cho thấy Taq- polymerase quyết định đến sản phẩm PCR và số lượng Taq-polymerase 1,0µl cho sản phẩm băng 16S rRNA rõ nhất trên gel.
- Trong các phản ứng có lượng dNTP (10 mM) thay đổi từ 2,0; 2,2; 2,4; 2,5; 2,6 µl còn các thành phần khác giữ nguyên: Taq-polymerase (1 U/µl) 1,0; DNA khuôn (40x) 2,5; Mồi (10 pmol) 1,25; Buffer 10x 2,5; số chu kỳ 45. Kết quả cho thấy hàm lượng dNTP càng tăng thì băng vạch càng sáng và đậm nét hơn. Lượng dNTP thích hợp nhất là 2,5µl.
- Hàm lượng DNA khuôn (40x) được thay đổi từ 2,2; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7 µl, còn các thành phần khác giữ nguyên là: dNTP 10 (mM) 2,5; Taq-
polymerase (1U/µl) 1,0 ; Mồi (10 pmol) 1,25; Buffer 10x 2,5; số chu kỳ 45. Kết quả cho thấy nồng độ DNA không làm thay đổi nhiều đến hiệu suất nhân bản.
- Nhiệt độ bắt cặp thay đổi từ 52 ; 53 ; 55; 600C, còn các thành phần khác giữ nguyên là : DNA khuôn (40x) 2,5; dNTP 10 (mM) 2,5; Taq-
Kết quả cho thấy nhiệt độ bắt cặp cũng là một trong những yếu tố quan trọng cho số băng vạch và độ đậm nét của băng, và nhiệt độ gắn mỗi tối ưu là 530C.
- Số chu kỳ trong phản ứng PCR được nghiên cứu thăm dò 45; 50; 55; 56; 57 chu kỳ, còn các thành phần khác giữ nguyên là: DNA khuôn (40x) 2,5; dNTP 10 (mM) 2,5; Taq-polymerase (1U/µl) 1,0; Mồi (10 pmol) 1,25; Buffer 10x 2,5 µl ; nhiệt độ 530C. Kết quả cho thấy với 45 chu kỳ thì phản ứng PCR cho nhiều vạch nhất và rõ hơn cả.
Tóm lại: Sau hàng loạt thử nghiệm tối ưu hoá, kết quả nghiên cứu xác
định điều kiện tối ưu để khuếch đại gen 16S rRNA được thể hiện tại bảng sau:
Bảng 3.4. Điều kiện của phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA và gen 23S rRNA
STT Thành phần Gen 16S rRNA Gen 23S rRNA
1 H2O 9 µl 9 µl
2 Buffer 10x 2,5 µl 2,5 µl
3 dNTP 10 mM 2,5 µl 2,5 µl
4 Mồi xuôi (F) 1,25 µl 1,25 µl
5 Mồi ngược (R) 1,25 µl 1,25 µl
7 Taq – polymerase (1 U/µl) 1,0µl 1,0 µl
8 DNA khuôn 2,5 µl 2,5 µl
9 Nhiệt độ 530C 550C
10 Số chu kì 45 45