4. Ý nghĩa của đề tài
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu bê ̣nh phẩm
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA của 100 mẫu bệnh phẩm viêm loét dạ dày. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu sinh thiết được tiến hành theo phương pháp của Ausubel(1995), bao gồm các bước sau:
Bước 1:
- Lấy ống mẫu bệnh phẩm ra khỏi bình chứa Nitơ lỏng, dùng chày nghiền chuyên dụng nghiền mẫu cho đến khi thành dạng dung di ̣ch mịn, sau đó bổ sung 100µl đệm phá tế bào LB (Lysis buffer).
- Chuyển dịch chiết DNA vào ống eppendorf, ủ ở 370C, trong thời gian 1 giờ.
- Bổ sung 2,5µl protease K (20mg/ml), lắc nhẹ cho đều và ủ mẫu qua đêm ở 560C (khoảng 8 - 16 giờ) để phá màng tế bào, giải phóng DNA.
Bước 2:
- Bổ sung 200 µl dung dịch CH3COONH4 7,5M và giữ mẫu ở 40C trong 1 giờ.
- Ly tâm 12000 vòng/phút, trong thời gian 30 phút, để ở 40C. Mẫu sẽ tách thành 3 pha: Pha trên cùng là DNA, pha giữa là protein không có khả năng hoà tan, pha dưới là Phenol: Chlorofom: Isoamyl. Hút lấy dịch pha trên hòa tan DNA và chuyển vào 1 ống eppendorf mới (lặp lại 2 lần).
Bước 3:
- Thêm 500 µl cồn 960, để ở -20oC trong 2 - 3 giờ, DNA kết tủa. Ly tâm 12000 vòng/phút, ở 4oC, trong 30 phút. Đổ phần dịch trong và thu tủa DNA.
- Thêm 500 µl cồn 70o để rửa sạch DNA. Ly tâm 12000 vòng/phút, ở 4oC, trong 20 phút. Đổ bỏ phần dịch, thu tủa DNA.
- Để khô DNA và bay hết cồn ở nhiệt độ phòng.
- Hoà tan DNA trong 30µl dung dịch đệm TE và bảo quản DNA ở 4oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.