4. Ý nghĩa của đề tài
2.3.5. Định lượng, định tính DNA bằng quang phổ kế
Sau khi thu nhận DNA, tiến hành xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp quang phổ kế.
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin và pirimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan sau:
Một đơn vị OD260 nm tương đương với nồng độ 50 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi; 40 µg/ml cho dung dịch RNA hay DNA sợi đơn.
Như vậy giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA trong mẫu và và được tính theo công thức:
CDNA (µl/ml) = OD 260nm x 50 x độ pha loãng
Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA trong dung dịch, đo thêm giá trị OD ở 280 nm, đây là bước sóng mà các protein có mức hấp thụ cao nhất. Nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các DNA và do đó làm sai lệch giá trị nồng độ thật của nồng độ DNA. Một dung dịch DNA được xem là sạch, không tạp nhiễm protein khi tỷ số OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8-2,0.
Cách tiến hành đo mật độ quang DNA: Hút 2 µl nước khử vô trùng vào
cuvet 1ml làm đối chứng. Sau đó lấy 2 µl DNA để đo OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Ghi lại các giá trị OD của các mẫu DNA được kiểm tra, từ các giá trị OD thu được ở hai bước sóng, có thể tính được nồng độ và độ tinh sạch của DNA theo công thức trên.