1. 3N ội dung thực hiện
2.4 Quy trình phân tích tổng quát
Hình 2.15 Quy trình phân tích tổng quát
Thuyết minh quy trình:
Mẫu: nước hay cá (tôm) phải hoàn toàn sạch không nhiễm dư lượng thuốc kháng sinh hay các chất TBVTV. Nếu là mẫu cá (tôm) thì xay nhuyễn trước khi tiến hành thí nghiệm.
Cân khối lượng mẫu cho vào ống ly tâm sau đó thêm các chất cần phân tích, vortex khoảng 1 phút và để khoảng 5 phút.
Cho dung môi chiết tách vào ly trích dư lượng các chất cần phân tích trong mẫu.
Gạn lấy phần dịch tiến hành cô cạn trên máy cô quay hoặc thổi dưới dòng khí Nitrogen ở 450C cho đến khi khô, hoàn nguyên bằng 1ml n-hexane, vortex, lọc cho vào vial chạy sắc ký.
Các mẫu được tiêm vào bộ phận tiêm mẫu của máy, chạy trên máy với điều kiện đã thiết lập sẵn.
Mẫu
Chiết tách
Làm sạch
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm nghiên cứu
Thực hiện nghiên cứu và thu thập số liệu tại bộ môn dinh dưỡng và chế biến thủy sản, khoa thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu
Mẫu cá Basa fillet (Basa AGIFISH, khối lượng 250g), tôm sú (91-120, Công Ty Cổ Phần TNHH Gia Đình) đông lạnh mau tại siêu thị CopMark và mẫu nước ao lấy tại khoa thủy sản đã lọc qua giấy lọc.
3.1.3 Thiết bị
Hệ thống máy sắc ký khí (GC 2010)
Hệ thống máy cô quay chân không (Rotavapor R-200) Thổi khí Nitrogen
Máy lắc ngang (SK-300) Máy ly tâm lạnh (Mikro 22B) Máy vortex (VX 100)
Các dụng cụ hỗ trợ việc ly trích trong phòng thí nghiệm: micropipet, bình cầu, ống ly tâm.... 3.1.4 Hóa chất Sodiumsunfat (Na2SO4) Acetol (CH3COCH3) Acetonitrile (CH3CN) Chloroform (CHCl3) Ethylacetate(CH3COOC2H5) Dichloromethan (CH2Cl2) Methanol (CH3OH)
Dung dịch chuẩn dichlorvos, trifluralin, malathion, diazinon
3.2.1 Thí nghiêm 1: Khảo sát chu trình nhiệt độ cột sắc ký trong quy trình phân tích đồng thời Malathion, Dichlorvos, Diazinon, Trifluralin trên sản phân tích đồng thời Malathion, Dichlorvos, Diazinon, Trifluralin trên sản phẩm thủy sản và nước bằng phương pháp sắc ký khí
3.2.1.1 Mục đích
Chọn chu trình nhiệt độ tối ưu nhất cho cột sắc ký trong quy trình phân tích.
3.2.1.2 Sơ đồ thí nghiệm
Hình 3.1 Sơ đồ thí nghiệm 1
Thí nghiệm được thực hiện với các chu trình nhiệt (CT) hay gọi là gradient nhiệt độ khác nhau trên cột sắc ký.
+ CT1: Nhiệt độ cột bắt đầu 1000C giữ 3 phút, tăng lên 1800C giữ 3 phút với tốc độ tăng 100C/phút, tăng lên 2600C giữ 6 phút với tốc độ tăng 250C /phút.
+ CT2: Nhiệt độ cột bắt đầu 1000C giữ 4 phút, sau đó tăng lên 1800C giữ 4 phút với tốc độ tăng 100C/phút, tăng lên 2600C giữ 5 phút với tốc độ tăng 150C /phút.
+ CT3: Nhiệt độ cột bắt đầu 1000C giữ 4 phút, sau đó tăng lên 1800C giữ 1 phút với tốc độ tăng 80C/phút, tiếp tăng lên 2600C giữ 7 phút với tốc độ tăng 150C /phút
+ CT4: Nhiệt độ cột bắt đầu 1000C giữ 5 phút, sau đó tăng lên 1800C giữ 4 phút với tốc độ tăng 70C/phút, tiếp tăng lên 2600C giữ 6 phút với tốc độ tăng 150C /phút
+ CT5: Nhiệt độ cột bắt đầu 1000C giữ 5 phút, sau đó tăng lên 1800C giữ 1 phút với tốc độ tăng 70C/phút, tiếp tăng lên 2600C giữ 6 phút với tốc độ tăng 150C /phút
3.2.1.3 Tiến hành
Dung dịch chuẩn pha loãng ở nồng độ 50 ppb trong vial rồi chạy trên máy GC.
CT1 CT2 CT3
Chạy sắc ký
CT4 CT5 Dung dịch chuẩn (50 ppb)
Trước khi tiêm mẫu vào máy thực hiện cài đặt các thông số cho máy như sau:
+ Nhiệt độ tiêm mẫu: 2500C
+ Lưu lượng khí qua cột: 0.9 ml/phút + Injection mode: Splite
+ Split ratio: 2.0
+ Nhiệt độ đầu dò: 2700C + Sampling Rate: 40 msec + Make up flow: 30 ml/phút
+ Nhiệt độ cột: lần lượt là CT1, CT2, CT3, CT4, CT5 như trên
Sau khi cài đặt xong ta nhấn “download” chuyển phần cài đặt trên vào máy sắc ký và nhấn “System on”.
Dùng thiết bị bơm chuyên dùng cho sắc ký khí hút 1µl bơm thật nhanh vào bộ phận tiêm mẫu trên máy sắc ký khí nhấn “Start” máy tự động phân tích.
Tín hiệu được ghi lại trên đồ thị sắc ký dưới dạng các peak, mỗi chất được đặc trưng bởi thời gian lưu của chất đó khi qua cột sắc ký.
3.2.1.4 Đánh giá
Hình dạng: peak (tín hiệu) càng cao và chân peak càng hẹp càng tốt. Thời gian lưu của peak.
3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu suất thu hồi khi cô cạn dung dịch chiết tách bằng hệ thống cô quay và thổi khí Nitrogen tách bằng hệ thống cô quay và thổi khí Nitrogen
3.2.2.1 Mục đích
Tìm ra phương pháp cô cạn dung dịch ly trích cho hiệu suất thu hồi tốt.
3.2.2.2 Sơ đồ thí nghiệm
Dung dịch chuẩn (50ppb)
3ml Acetonitrile
Cô quay Khí Nitrogen
Hoàn nguyên 1ml Hexan Hoàn nguyên 1ml Hexan
Loc-GC/ECD Loc-GC/ECD
3.2.2.3 Tiến hành
Spike chuẩn trước:
- Cô cạn trên hệ thống cô quay: Dùng pipet hút 50l hỗn hợp dung dịch chuẩn ở nồng độ 1ppm cho vào bình cầu quả lê chứa 3ml acetonitrile. - Cô cạn bằng thổi khí: cho 50l hỗn hợp dung dịch chuẩn ở nồng độ 1ppm vào ống fancol chứa 3ml acetonitrile.
- Sau khi cô cạn hoàn lưu lại 1 ml hexan, lọc qua fiter có Ø= 0.2m, chaỵ GC/ECD.
Spike chuẩn sau: tiến hành cũng giống các bước spike chuẩn trước nhưng sau khi cô cạn dung dịch mới spike chuẩn vào trước khi hoàn nguyên lại bằng hexan.
3.2.2.4 Đánh giá
Đánh giá diện tích peak và hiệu suất thu hồi.
3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu suất thu hồi khi cho dung dịch chuẩn qua cột SPE có hoạt hóa và không có hoạt hóa qua cột SPE có hoạt hóa và không có hoạt hóa
3.2.3.1 Mục đích
Tìm ra phương pháp trong quá trình phân tích để cho tín hiệu peak của các chất phân tích lớn tăng hiệu suất thu hồi.
3.2.3.2 Sơ đồ thí nghiệm
Hình 3.3 Sơ đồ thí nghiệm 3
3.2.3.3 Tiến hành
Dung dịch chuẩn100 ppb Thêm 10ml Hexan SPE không hoạt hóa SPE hoạt hóa
Hứng dung dịch qua cột Hứng dung dịch rửa giải
Cô cạn Cô cạn
Hoàn nguyên 1ml Hexan Lọc-GC/ECD
Hoàn nguyên 1ml Hexan Lọc-GC/ECD
- Dùng pipet hút 100l hỗn hợp dung dịch chuẩn nồng độ 1 ppm vào ống fancol chứa 10 ml Hexan.
- Qua cột SPE hoạt hóa 2ml dichlomethan, 2ml methanol, 2ml nước cất dùng cho sắc ký, cho dung dịch chuẩn qua cột, rửa giải lại 2ml dichlomethan hứng dung dịch rửa giải.
- Qua cột không hoạt hóa cho dung dịch qua cột hứng dung dịch lại. - Cô cạn dung dịch, hoàn nguyên 1ml hexan, lọc chạy GC/ECD.
Spike chuẩn sau: tiến hành giống spike chuẩn trước nhưng sau cô cạn dung dịch mới spike chuẩn vào.
3.2.3.4 Đánh giá
Diện tích peak và tỷ lệ thu hồi.
3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát dung môi trích ly thích hợp trong quy trình phân tích đồng thời các chất dichlorvos, trifluralin, diazinon, malathion phân tích đồng thời các chất dichlorvos, trifluralin, diazinon, malathion trên sản phẩm thủy sản và nước
3.2.4.1 Mục đích
Nhằm tìm ra chất chiết tách cho kết quả tốt nhất.
3.2.4.2 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm Spike chuẩn trước:
Cân 2g mẫu cá, tôm (nghiền) cho vào ống ly tâm 15ml, spike 100l hỗn hợp chuẩn thuốc trừ sâu ở nồng độ 1ppm vào, vortex và để khoảng 15 phút, thêm dung dịch dùng ly trích (Acetonitril, ethylacetat hoặc acetonitril : aceton (tỉ lệ 1:1)), vortex khoảng 1 phút, lắc 20 phút, ly tâm 20 phút (tốc độ 5000 rpm, 250C), gạn lấy phần dịch trong cho vào bình cầu thuỷ tinh nếu cô cạn bằng hệ thống cô quay hoặc ống fancol mới khi thổi khô 450C. Phần rắn cho lại dung môi ly trích chiết tách lần 2.
Riêng dung dịch ly trích bằng acetonitrile chia ra trong 2 ống fancol cho vào 5ml nước và 5ml Choloform lắc đều, ly tâm 10 phút (5000 rpm, 250C), dung dịch tách thành 2 lớp, lấy lớp dưới cho vào bình cầu thuỷ tinh nếu làm khô bằng hệ thống cô quay hoặc ống fancol mới khi thổi khô 450C, bỏ lớp dung dịch phía trên.
Trên mẫu nước: 50ml vào bình chiết tách có van xả, spike 50l dung dịch chuẩn nồng độ 1 ppm vào lắc đều, thêm dung môi chiết tách (acetonitrile, etylacetate, dichlomethan) vào lắc 1 phút, cho choloform vào dung dịch tách 2
lớp, vặn van xả lấy lớp dưới cho vào ống fancol đi thổi khô. Riêng dung môi ly trích dichlomethan không thêm choloform.
Cô cạn dung dịch, hoàn nguyên lại 1 ml n-hexane (vortex 1 phút), lọc qua fiter (Ø = 0.2µm) cho vào vial, chạy sắc ký.
Spike chuẩn sau: tiến hành như các bước spike chuẩn trước, sau khi cô cạn dung dịch mới spike chuẩn vào.
Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng cũng được tiến hành chuẩn bị giống như mẫu thí nghiệm.
Chạy sắc ký: mẫu sau khi chiết tách và làm sạch xong thì tiến hành chạy sắc ký ngay.
3.2.4.3 Bố trí thí nghiệm
Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4 (trên mẫu cá và tôm) - A1: Acetonitrile
- A2: Ethylacetat
- A3: Acetonitrile : Aceton
A3 Mẫu
Dung dịch chuẩn thuốc trừ sâu
A1
Chiết tách
Cô quay ở 450C Hoàn lưu 1ml n-hexane Lọc (Ø = 0.2µm) cho vào vai
Vortex 1 phút, Lắc 20 phút Ly tâm 20 phút
Chạy sắc ký khí A2
Hình 3.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4 (trên mẫu nước)
Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố B (dung môi ly trích) - B1: Acetonitrile - B2: Ethylacetate - B3: Ethylacetate-SPE - B4: Dichloromethan Số lần lặp lại: 2lần Số nghiệm thức: 3 x 2 = 6 3.2.4.4 Đánh giá
Hiệu suất thu hồi, độ nhiễu nền của sắc ký đồ và độ ổn định.
3.3 Xử lý số liệu
Thu nhập số liệu tại phòng thí nghiệm thống kê và phân tích trên Microsoft Excel và phần mềm SPSS.
B4 Mẫu
Dung dịch chuẩn thuốc trừ sâu
B1
Chiết tách
Cô quay ở 450C Hoàn lưu 1ml n-hexane Lọc (Ø = 0.2µm) cho vào vai
Vortex 1 phút, Lắc 20 phút Ly tâm 20 phút
Chạy sắc ký khí
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát chu trình nhiệt độ cột sắc ký trong quy trình phân tích đồng thời Malathion, Dichlorvos, Diazinon, Trifluralin trên sản phẩm tích đồng thời Malathion, Dichlorvos, Diazinon, Trifluralin trên sản phẩm thủy sản và nước bằng phương pháp sắc ký khí
Kết quả chạy sắc ký khí với dung dịch chuẩn 50 ppb áp dụng ở các chu trình nhiệt độ cột sắc ký khác nhau như sau:
Hình 4.1 Sắc ký đồ chạy chuẩn 50ppb ở các chu trình nhiệt độ khác nhau Bảng 4.1 Thời gian lưu của từng chất khi chạy sắc ký khí với dung dịch chuẩn ở nồng độ 50 ppb theo các chu trình nhiệt độ.
Thời gian lưu (phút) Chu trình nhiệt
độ (CT)
Nồng độ dung dịch chuẩn 4 chất
(ppb) Dichorvos Trifluralin Diazinon Malathion
CT1 50 10,74 17,83 19,71 22,09 CT2 50 11,53 19,74 21,83 23,91 CT3 50 12,23 19,72 21,30 23,40 CT4 50 14,23 24,43 26,44 29,06 CT5 50 14,24 22,61 24,35 26,65 CT5 CT4 CT3 CT2 CT1
- 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Chu trình nhiệt độ D iệ n t íc h Dichorvos Trifluralin Diazinon Malathion
Hình 4.2 Đồ thị biểu thị diện tích peak sắc ký (tín hiệu) của dung dịch chuẩn trifluralin, dichlorvos, diazinon, nalathion ở nồng độ 50 ppb chạy bằng sắc ký
khí ở các chu trình nhiệt độ cột khác nhau.
Kết hợp từ bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy các chất cần phân tích có thời gian lưu ở mỗi chu trình nhiệt độ khác nhau. Do khi đi qua cột mỗi chất có sự tương tác (ái lực) với cột như: tương tác tĩnh điện, tương tác cộng hóa trị, tương tác giữa các nhóm chức của pha tĩnh với chất phân tích… Chất nào có ái lực ít với cột thì thời gian lưu ngắn, ngược lại chất có ái lực lớn với cột thì thời gian lưu dài hơn.
Ở tất cả các chu trình điều bắt đầu nhiệt độ cột 1000C, tăng lên 1800C và 2600C chỉ khác nhau về thời gian giữ nhiệt và tốc độ gia nhiệt nên ở từng chu trình nhiệt độ thì làm cho ái lực của các chất với cột cũng thay đổi do đó thời gian lưu của mỗi chất trong từng chu trình nhiệt khác nhau.
Chu trình nhiệt độ 1, 2 và 3 khoảng cách thời gian lưu và diện tích peak dichlorvos, trifluralin, diazinon, malathion không khác biệt nhiều, thời gian lưu ngắn các peak chất phân tích nằm gần các peak tạp của dung môi vì vậy khi tiến hành trên mẫu khó phát hiện peak của chất cần phân tích, độ trôi nền giống nhau. Ở chu trình nhiệt độ 4 thời gian lưu của từng chất lâu hơn chu trình 1, 2, 3 diện tích peak lớn hơn nhưng độ trôi nền lớn. Ở chu trình 5 thời gian lưu các chất phân tích ngắn hơn chu trình 4, dài hơn chu trình 1, 2, 3 nhưng các peak chất phân tích tách xa peak dung môi, không bị trùng lấp hay bị nhiễu do ảnh hưởng của các peak lạ, độ trôi nền thấp diện tích peak và chiều cao chất phân tích lớn hơn tất cả các chu trình.
Chua Nhong Tu (2004) khi phân tích 15 loại thuốc trừ sâu trên hệ thống Agilent 6280 Gas Chronatography/Nitrogen Phosphorus detector với nông độ dung dịch chuẩn 1ppm, nhiệt độ ban đầu 600C giữ 1 phút, tăng 2000C (tốc độ
100C/min), tăng 2500C (tốc độ 50C/min, giữ 5 phút). Cho kết quả thời gian lưu từng chất: methamidophos (8,26 phút), dichlorvos (8,63 phút), acephate (11,21 phút), monocrotophos (14,44 phút), phorate (14,60 phút), dimethoate (15 phút), parathion-methyl (17,03 phút), fenitrothion (17,75 phút), malathion (18,04 phút), fenthion (18,27 phút), parathion (18,34 phút), chloryrithion (18,34 phút), methidathion (19,97 phút), ethion (22,52 phút) và triazophos (22,92 phút). Khoảng cách thời gian lưu các chất không lớn, dichlorvos và malathion thời gian lưu ngắn hơn chu trình đang chạy.
Hình 4.3Sắc ký đồ chạy chuẩn trên máy (CT5)
Vậy áp dụng chu trình nhiệt độ cột bắt đầu 1000C giữ 5 phút, tăng 1800C giữ 4 phút (tốc độ tăng 70C/phút), tăng 2600C giữ 6 phút (tốc độ tăng 150C/phút) trên máy khi phân tích đồng thời dichlorvos, trifluralin, diazinon, malathion là thích hợp nhất. Cho giới hạn phát hiện trên máy lần lượt dichlorvos (10 ppb), trifluralin (0,5 ppb), diazinon (10 ppb), malathion (10 ppb). Dichlorvos Trifluralin M ala th io n D ia zi n o n 50ppb 10ppb
4.2 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi khi cô cạn dung dịch chiết tách bằng hệ thống cô quay và thổi khí Nitrogen bằng hệ thống cô quay và thổi khí Nitrogen
Cách tính hiệu suất thu hồi dựa trên diện tích peak
Bảng 4.2 Hiệu suất thu hồi diện tích peak giữa hai hệ thống cô cạn dung dịch chuẩn 58% 63% 59% 90% 30% 62% 45% 29% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%
Dichlorvos Triluralin Diazinon Malathion
Các chất phân tích
%
Thổi khô
Cô quay
Hình 4.4 Đồ thị biểu thị tỷ lệ phần trăm diện tích peak các chất phân tích khi thổi khô và cô quay.
Tỷ lệ % thu hồi này dựa trên diện tích peak giữa spike chuẩn trước và sau. Khi cô cạn bằng hệ thống cô quay diện tích tiếp xúc lớn nên mau khô nhưng tỷ lệ hao hụt lớn hay nhỏ tuỳ theo tính chất từng chất. Khi thổi khô bằng khí do diện tích tiếp xúc ít nên khi cô cạn lâu hơn nhưng tỷ lệ thu hồi lớn dựa theo đồ thị hình 4.3 thì khi thổi khô tỷ lệ thu hồi đa số các chất đều cao hơn cô quay. Khi cô cạn dung dịch nên sử dụng hệ thống thổi khí nitrogen.
Hiệu suất thu hồi diện tích peak Các chất phân tích Nồng độ
(ppb)
Thổi khô Cô quay
Dichlorvos 50 58% 30%
Triluralin 50 63% 62%
Diazinon 50 59% 45%
Malathion 50 90% 29%
Diện tích peak spike chuẩn trước Diện tích peak spike chuẩn sau
4.3 Kết quả khảo sát khi cho hỗn hợp dung dịch chuẩn qua cột SPE
Bảng 4.3 Diện tích peak khi cho dung dịch các chất phân tích qua cột SPE
Trung bình diện tích peak Các chất phân
tích Nông độ (ppb) Qua cột SPE có hoạt hóa
Qua cột SPE không hoạt hóa Dichlorvos 100 0 147916 74111b Trifluralin 100 696114 84405a 464882 114593b Diazinon 100 0 27437 6213b Malathion 100 0 54154 490a 0.00 100,000.00 200,000.00 300,000.00 400,000.00 500,000.00 600,000.00
Qua cột SPE có hoat hóa Qua cột SPE không hoạt hóa
D iệ n tí c h p e a k Dichlorvos Trifluralin Diazinon Malathion
Hình 4.5 Đồ thị biểu thị diện tích peak khi cho dung dịch các chất phân tích qua cột SPE
Dung môi dùng hoạt hóa qua cột SPE làm cho mạch cacbon duỗi thẳng bắt những chất phân tích, sự tương tác giữa các chất và cột khác nhau tùy thuộc tính chất của mỗi chất. Nếu chất nào tương tác tốt với cột sẽ bị giữ lại