Chương 2: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
2.2 Giới thiệu về phương pháp sắc ký
2.2.1 Lịch sử phát triển phương pháp sắc ký
Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh ra kỹ thuật sắc ký vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. Ông nhận thấy rằng, khi cho nước lá xanh được chiết bằng ete đi qua giấy lọc thì thấy các dãy màu khác nhau hiện lên rõ rệt – dãy màu vàng và dãy màu lục.
Chữ sắc trong sắc ký có nghĩa là màu; nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, và vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc
bấy giờ. Tên này vẫn tiếp tục được dùng dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc.
Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge phân tích các chất béo bằng phương pháp sắc ký đầu tiên để thử nghiệm đến năm 1952 trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc ký phân bố. Kỹ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau. Đồng thời, kỹ thuật thực hiện sắc ký cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau.
2.2.2 Khái niệm về phương pháp sắc ký
Sắc ký là kỹ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong phân bố giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp. Các thành phần của hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnh dựa trên điện tích, độ tan tương đối và tính hấp phụ.
Trong đó, pha động mang chất phân tích di chuyển qua pha tĩnh, pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian. Một cách lý tưởng, mỗi thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là "thời gian lưu."
Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp được mang đi bởi chất lỏng (sắc ký lỏng) hoặc khí (sắc ký khí) và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hay lỏng.
Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua, như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate.
Sắc ký là kỹ thuật tách và phân tích các chất trong hỗn hợp mẫu dựạ theo những tính chất hoá học, vật lý của các chất trong những điều kiện nhất định như:
- Tính chất trao đổi ion hay cặp ion.
- Tính chất hấp phụ của các chất - Sự tạo phức và liên hợp các phân tử - Sự rây phân tử theo kích thước của chúng
- Sự phân bố của các chất của hai pha không tan vào nhau
Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa theo trạng thái của chất mẫu và pha động khi tiến hành sắc ký. Gồm kỹ thuật sắc ký khí và kỹ thuật sắc ký lỏng, trong kỹ thuật sắc ký lỏng ta có thể chia thành hai nhóm nhỏ là sắc ký lỏng áp suất thường và sắc ký lỏng hiệu suất cao.
2.2.3 Sắc ký khí
Sắc kí khí là phương pháp tách những chất bay hơi (hay được làm cho bay hơi) qua cột. Những chất này được dẫn đi bằng một khí trơ gọi là khí mang.
2.2.3.1 Các bộ phận của hệ thống sắc ký khí
Hình 2.13 Hệ thống sắc ký khí (GC) - Lò nung
- Nguồn mang khí - Buồng tiêm mẫu
- Bộ phận phát hiện hay đầu dò (detector) (4) - Bộ phận ghi tính hiệu
- Cột sắc ký
2.2.3.2 Nguyên lý hoạt động
Cơ chế: Sắc kí phân bố giữa pha tĩnh và khí mang, sắc kí hấp phụ trên pha tĩnh. Việc lựa chọn kiểu cột tách sẽ phụ thuộc vào các đặc tính lý hóa của chất phân tích và sự khác biệt về áp suất hóa hơi (P).
Nguyên lý hoạt động: phương pháp sắc ký khí dùng nhiệt để tách các chất nên thường dùng để tách những chất dễ bay hơi và bền nhiệt.
Đầu tiên mẫu được bơm vào thiết bị tiếp nhận mẫu. Hút một lượng mẫu là 1àl bằng dụng cụ tiờm mẫu chuyờn dựng cho sắc ký khớ sau đú tiến hành bơm nhanh mẫu vào buồng tiêm mẫu của hệ thống máy và nhấn “Start”
và để máy tự động phân tích mẫu. Thiết bị tiêm mẫu có hệ thống gia nhiệt nên mẫu bị bay hơi tức khắc và được đẩy vào cột khí bằng khí mang.
Trong cột sắc ký xảy ra quá trình tách chất. Mỗi chất đi qua cột với thời gian lưu nhất định. Các chất trong cột được tách ra do ái lực của nó với chất áo trên cột. Ái lực của chất với cột mạnh thì nó sẽ bị giữ lại trong cột lâu, thời gian lưu dài, chất có ái lực với cột nhỏ sẽ được khí mang ra khỏi cột trước, thời gian lưu nhỏ. Trong cột sắc kí, các chất tách ra phụ thuộc rất nhiều vào quá trình thay đổi nhiệt độ (lập trình nhiệt). Nếu lập trình nhiệt không hợp lý các peak sẽ rất gần nhau rất khó đọc.
Các chất tách ra từ cột lần lượt được đưa đến đầu dò gọi là Detector là một máy biến năng chuyển bức xạ điện tử thành tín hiệu điện.
Dòng tín hiệu từ đầu dò đi ra được khuếch đại đưa vào hệ thống ghi nhận kết quả và hiển thị trên màng hình máy vi tính.
2.2.3.3 Đầu dò bắt điện tử (ECD - electron capture detection)
ECD là đầu dò được dùng rộng rãi trong GC hiện nay được dùng nhiều trong phân tích môi trường và dược phẩm. Thiết kế ECD chỉ đơn giản gồm một buồng kín chứa hai điện cực và một nguồn phát bức xạ electron để ion hóa. Cấu tạo ở (a) gồm có anode và cathode được thiết kế đồng trục. Trong khi đó ở (b), nguồn bức xạ là một tấm mỏng, anode và cathode được thiết kế tạo thành hai mặt phẳng song song.
Hình 2.14 Cấu tạo của đầu dò ECD
Bình thường, dòng khí mang (hay sử dụng là N2) đi qua sẽ bị các electron bức xạ từ 63Ni ion hóa tạo nên các ion dương. Các ion và electron này di chuyển giữa hai điện cực và tạo thành dòng điện nền cân bằng Io. Khi trong dòng khí xuất hiện hợp chất có mang nguyên tử độ âm điện cao, nó sẽ bắt electron và phản ứng với các ion theo phương trình.
MX + e- → MX- MX- + N2+ → M + N2
Do đó, cường độ dòng sẽ giảm và sẽ được detector ghi nhận.
Ưu điểm:
Đầu dò bắt điện tử rất nhạy, có thể phát hiện một số loại hợp chất khi chúng hiện diện ở nồng độ cực nhỏ.
Không làm hư hại mẫu khi mẫu đi ngang qua bộ phận đầu dò nên thích hợp cho loại sắc ký khí sử dụng cho cột điều chế.
Đơn giản.
Nhược điểm:
Chỉ nhạy với một số ít hợp chất còn các loại hợp chất khác sẽ không cho tín hiệu mũi trên sắc ký đồ.
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách chất trong sắc ký khí:
Áp suất hơi của một hợp chất:
- Áp suất hơi là số đo cho biết khả năng của những phân tử chất lỏng có thể biến đổi từ thể lỏng sang thể khí. Các hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ,
tính phân cực kém, sẽ có giá trị áp suất hơi lớn và ngược lại, các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn, tính phân cực mạnh, có giá trị áp suất hơi nhỏ.
- Các hợp chất có áp suất hơi lớn, chịu tác động mạnh mẽ của dòng khí pha động sẽ nhanh chóng ra khỏi cột (với điều kiện các hợp chất hòa tan kém vào pha tĩnh). Các hợp chất này có thời gian lưu nhỏ.
- Các hợp chất có áp suất hơi lớn nhưng khả năng hòa tan vào pha tĩnh cũng lớn sẽ ra khỏi cột chậm hơn có thời gian lưu trung bình.
- Các hợp chất có áp suất hơi nhỏ, có khả năng hòa tan vào pha tĩnh lớn sẽ ra khỏi cột rất chậm, có thời gian lưu lớn.
Đặt trưng của các loại cột sắc ký:
- Việc tách riêng từng cấu tử của hỗn hợp tùy thuộc vào sự tương tác của các cấu phần đó đối với pha tĩnh, hệ quả là thời gian lưu của mỗi cấu phần sẽ khác nhau.
Độ phân giải Rs:
- Một sắc ký đồ được xem là phân giải tốt khi các tính hiệu mũi ở gần bên nhau tách rời nhau ra nghĩa là tính hiệu đường của các mũi này tách rời.