Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa hạt nano bạc như:
- Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm hạt nano bạc có tác dụng khử trùng. Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt 99.9% vi khuẩn.
34
Hình 2.5: Bình sữa làm bằng nhựa có pha thêm nano bạc
- Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử mùi.
Hình 2.6: Tất làm bằng sợi nilon có pha nano bạc
35 - Y tế:
+ Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3-4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp vật liệu tẩm nano bạc và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả năng diệt khuẩn, diệt virus, lọc không khí rất tốt. Lớp vải tẩm nano bạc có chức năng diệt vi khuẩn, virus, nấm bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác dụng khử mùi.
Hình2.7: Khẩu trang nano bạc do viện môi trường sản xuất
+ Sản xuất thuốc chữa bệnh
36 + Màng hô hấp: Đó là một tấm màng mỏng có thể cho khí và hơi nước qua nhưng không thể cho chất lỏng đi qua, có vô số những lỗ khí nhỏ tồn tại trong tấm film. Các hạt nano bạc gần đây đã được kết hợp với film polyolefin với đặc tính kháng khuẩn rất tốt.
- Các sản phẩm khác:
37
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu
3.1.1. Nguồn mẫu.
Nguồn mẫu là hạt giống măng tây Hạt giống hiệu Tân Nông Phát
Nano bạc: dung dịch nano bạc thương mại có thành phần: nano bạc 200mg/l, Trisodium citrate 35%, Glucose, Nitrogen và nước cất vừa đủ được sản xuất bởi công ty CP Đầu tư và Phát triển Bắc Sơn.
3.1.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962), ½MS (môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng giảm đi một nửa), ¼ MS (môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng giảm đi một phần tư) có bổ sung 3 g l sucrose và 8,0 g l agar. Tùy theo thí nghiệm mà các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau được sử dụng ( NAA, BA). Các thí nghiệm được điều chỉnh pH về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121ºC, 1 atm trong 3 phút. Mẫu được cấy vào bình thủy tinh 100 ml chứa 2 ml môi trường, mỗi nghiệm thức 30 mẫu (3 mẫu bình, 3 lần lặp lại).
3.1.3. Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 25 ± 2ºC, thời gian chiếu sáng 10 giờ ngày với cường độchiếu sáng 2 lux và độ ẩm trung bình 75 - 80%.
3.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài được tiến hành tại Phòng công nghệ sinh học nuôi cấy mô, trường Đại Học Tôn Đức Thắng, số 19 Nguyễn Hữu Thọ, Phường Tân Phong, quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh.
38
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Khử trùng mẫu cấy
- Rửa hạt bằng xà phòng, lắc đều 2 -3 phút.
- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy dưới vòi nước chảy mạnh.
- Vô trùng sơ bộ bằng cồn 70%, lắc đều 1 -2 phút.
- Rửa sạch cồn bằng nước vô trùng.
- Cho hạt vào dung dịch khử trùng NaOCl 1 %. Khử trùng trong 2 phút. Và đem (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
vào buồng cấy để khử trùng.
- Rửa sạch chất khử trùng nhiều lần bằng nước vô trùng (khoảng 5 lần)
Nuôi cấy khởi động:
Sau khi khử trùng, mẫu được cấy vào môi trường MS để tạo mẫu chồi sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1. Bố trí thí nghiệm
3.2.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự nảy mầm và phát triển chồi in vitro và phát triển chồi in vitro
Hạt sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS, ½ MS, ¼ MS bổ sung 30g/l sucrose, 8 g/l agar.
Chỉ tiêu theo dõi :
Theo dõi sự sinh trưởng sau 4 tuần :
- Tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi (%) = (Số mẫu cấy tạo chồi/ Tổng số mẫu cấy) x 100
- Số chồi/ mẫu cấy
- Chiều cao chồi (cm)
39 Đoạn thân mang chồi nách .5-1cm được cấy sang môi trường khoáng tốt nhất trong thí nghiệm 1 và bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau ( ; ,5; 1, ; 1,5; 2, ) mg l để theo dõi khả năng nhân nhanh chồi của mẫu sau 4 tuần nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:
Theo dõi sự sinh trưởng sau 4 tuần :
- Số chồi/ mẫu cấy
- Chiều cao chồi (cm)
- Chiều dày thân chồi (mm)
3.2.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ từ mẫu cấy chồi nách in vitro cấy chồi nách in vitro
Chọn những chồi có chiều cao từ 1 – 2 cm thí nghiệm trên để tạo thành cây hoàn chỉnh. Chồi được cấy trên môi trường khoáng tốt nhất ở thí nghiệm 1 và có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau ( ; ,5; 1, ; 1,5; 2, ) để khảo sát khả năng hình thành rễ, tạo cây hoàn chỉnh. Chỉ tiêu theo dõi bao gồm số rễ và chiều dài rễ sau 4 tuần nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi :
Theo dõi sự sinh trưởng sau 4 tuần:
- Số chồi/ mẫu cấy
- Chiều cao chồi (cm)
- Số rễ/ mẫu cấy
- Chiều dài rễ (cm)
3.2.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa và NAA lên sự hình thành rễ từ mẫu cấy chồi in vitro rễ từ mẫu cấy chồi in vitro
Mẫu chồi in vitro có kích thước 2 cm và đồng đều về chiều dày của thân lấy từ cái thí nghiệm trên được cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 30 g/l sucrose , 8 g/l agar ,
40 2 ml l nước dừa và chất điều hòa sinh trưởng NAA với các nồng độ khác nhau ( ; ,5; 1, ; 1,5; 2, ; 3, ) mg l để khảo sát sự hình thành rễ, tạo cây hoàn chỉnh.
Chỉ tiêu theo dõi : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo dõi sự sinh trưởng sau 4 tuần:
- Số chồi/ mẫu cấy
- Chiều cao chồi (cm)
- Số rễ/ mẫu cấy
- Chiều dài rễ (cm)
3.2.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của BAP và NAA lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo cây măng tây từ mẫu cấy chồi in vitro sinh mô sẹo cây măng tây từ mẫu cấy chồi in vitro
Chồi in vitro được cắt thành những đoạn nhỏ có kích thước 0,5 cm cấy lên môi trường có
bổ sung BAP và NAA với các nồng độ khác nhau ( ; ,5; 1, ; 1,5; 2, ) mg l. Nuôi cấy trong khoảng thời gian 4 tuần. Chỉ tiêu theo dõi là trọng lượng khô, trọng lượng tươi, hình thái mô sẹo. Sau 4 tuần nuôi cấy mố sẹo được lấy ra và cân để thu được trọng lượng tươi,
sau đó sấy ở nhiệt độ 600C đến khi khối lượng không đổi ta thu được trọng lượng khô của
mô sẹo.
Chỉ tiêu theo dõi :
Theo dõi sự sinh trưởng sau 6 tuần :
- Trọng lượng tươi (g)
- Trọng lượng khô (g)
3.2.1.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc lên sự sinh trưởng của cây con in vitro con in vitro
Chọn những chồi có kích thước từ 2 cm và có độ đồng nhất về chiều dày thân chồi trong thí nghiệm 3 chuyển sang môi trường có bổ sung nano bạc với các nồng độ khác nhau
41 Theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy:
- Chiều cao cây (cm)
- Số lượng chồi
- Tỷ lệ mẫu ra rễ
- Số rễ trên mẫu cấy
- Chiều dài rễ (cm)
3.2.1.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc lên sự nhiễm và sinh trưởng của chồi in vitro trưởng của chồi in vitro
Mẫu chồi in vitro có kính thước 2 cm và có độ đồng đều về chiều dày của thân từ các mẫu có sẵn trong các thí nghiệm trước được cấy trên môi trường MS cơ bản bổ sung 30 g/l succrose, g l agar và nano bạc với các nồng độ khác nhau.
Các dụng cụ như lọ thủy tinh, nắp đậy được khử trùng qua nước Javen 1 % trong 2 phút sau đó được sấy khô trước khi rót môi trường vào.
Chỉ tiêu theo dõi:
Theo dõi sau 3 ngày, 7 ngày, 4 tuần :
- Tỉ lệ nhiễm (%) = (số mẫu nhiễm/ Tổng mẫu cấy) x 100
- Số chồi/ mẫu
42 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1Ảnh hưởng của môi trường khoáng đa lượng lên sự phát triển chồi in vitro.
Trong nuôi cấy mô vi nhân giống cây trồng, nhân chồi là một trong những công đoạn quan trọng. Hệ số nhân chồi cũng như chất lượng chồi có ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng và chất lượng giống cây trồng. Đối với măng tây, hệ số nhân chồi phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó hàm lượng khoáng đa lượng trong môi trường nhân giống đóng vai trò quan trọng.
Đề tài tiến hành thí nghiệm với nồng độ khoáng thay đổi khác nhau trong môi trường cơ bản MS. Kết quả thể hiện ở bảng 4.1
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của các loại khoáng đa lượng đến khả năng hình thành chồi Măng tây
Nồng độ khoáng đa lượng Chiều cao cm Số chồi
MS ½ MS ¼ MS 6,56a 2,77b 1,49c 3,60a 2,60b 1,30c
Ghi chú: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,…) được nêu ra trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với α=0,05 trong Duncan’s test
Kết quả trên cho thấy với đối tượng Măng tây, số lượng chồi hình thành nhiều nhất (3,60) là chiều cao chồi tốt nhất (6,56 cm) trên môi trường MS với nồng độ khoáng giữ nguyên. Môi trường có nồng độ khoáng ¼ MS (nồng độ khoáng đa lượng giảm ¼ so với môi
43 trường MS cơ bản) cho khả năng hình thành chồi (1,3 ) cũng như chiều cao chồi (1,49 cm) là thấp nhất. Điều này chứng tỏ khoáng đa lượng có ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành và phát triển chồi Măng tây, nồng độ khoáng đa lượng cao giúp cung cấp đầy đủ các nhu cầu khoáng thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển chồi của cây.
Ở một số loài cây thì nhu cầu về khoáng đa lượng không cao, thông thường khoáng đa lượng thích hợp cho chúng là môi trường ½ MS. Tuy nhiên Măng tây có nhu cầu về khoáng đa lượng khoáng cao, môi trường MS có nồng độ khoáng đa lượng được giữ nguyên là thích hợp nhất cho sự phát triển của chồi. Có khá ít nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng đối với Măng tây nhưng nhóm tác giả Jianwu Ren, Wenjing Chen, Mikołaj Knaflewski ( 2 12) cũng cho kết quả là môi trường MS có nồng độ khoáng đa lượng giữ nguyên cho hiệu quả tốt nhất đến sự phát triển của Măng tây.
44
Hình 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng ¼ MS, ½ MS, MS lên sự phát triển chồi in vitro
4.2 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân nhanh chồi.
Giai đoạn nhân nhanh chồi là giai đoạn tăng nhanh số lượng cần thiết nhằm phục vụ cho
nhân giống từ chồi in vitro có sẵn. Chất điều hòa sinh trưởng BAP được sử dụng có hoạt
tính mạnh hơn nhiều so với kinetine và giá cả cũng rẻ hơn, không bị phân hủy khi bị hấp khử trùng ở nhiệt độ cao. Thí nghiệm tiến hành trên môi trường MS với nồng độ chất điều hòa sinh trường BAP lần lượt là ; ,5; 1, ; 1,5; 2, mg/l. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.2
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân nhanh chồi Măng tây
Nồng độ BAP(mg l) Chiều cao (cm) Chiều dày (mm) Số chồi
0 0,5 1,0 1,5 2,0 12,85a 1,31c 2,60b 1,27bc 0,96c 1,00c 1,52b 2,83a 1,38b 1.32b 0,0d 2,50b 4,10a 2.30b 1,70c
Hình 4.2 Ảnh hưởng của BAP với các nồng độ 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l lên khả năng nhân nhanh chồi Măng tây
45 Kết quả cho thấy các nồng độ BAP khác nhau cho khả năng tăng trưởng chồi khác nhau. Những chồi trên môi trường không bổ sung BAP không thấy sự xuất hiện chồi mới sau 4 tuần nuôi cấy. Tại các môi trường có bổ sung nồng độ ,5 mg l 1,5 mg/l; 2,0 mg/l BAP số
lượng chồi, chiều cao và đường kính chồi Măng tây in vitro có sự chênh lệch nhau không
đáng kể. Nồng độ 1, mg l cho kết quả tốt nhất với số lượng chồi (4,1), chiều cao (2,6 cm), đường kính (2,83 mm). Như vậy, nồng độ BAP thích hợp sẽ giúp cây phát triển tốt về số lượng chồi, chiều cao cũng như đường kính của chồi, giúp chồi của măng tây chắc và khỏe hơn với việc hình thành chồi không có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP vào môi trường nuôi cấy.
4.3Ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ từ mẫu cấy chồi in vitro
Giai đoạn này được thực hiện sau nhiều lần cấy chuyền nhân chồi đạt đến số lượng cần thiết cho quá trình nhân giống và mẫu bắt đầu tiến hành hình thành cây hoàn chỉnh.Trong thí nghiệm này, NAA được sử dụng nhằm kích thích quá trình phát sinh rễ ở chồi Măng tây in vitro với các nồng độ lần lượt là ; ,5 ; 1,0 ; 1,5 ; 2,0 mg/l
Bảng 4.3Ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ từ mẫu cấy chồi in vitro
Nồng độ NAA mg l Chiều cao (cm) Số chồi
0 0,5 1,0 1,5 2,0 6,0ab 5,3b 5,2b 6,2a 5,3a 1.0b 2,0a 1,2b 1,4b 1,0b
Từ kết quả thí nghiệm ở bảng trên ta thấy việc sử dụng NAA nhằm mục đích tạo rễ cho chồi măng tây là không đạt được kết quả tốt. Ở tất cả các nghiệm thức đều thấy không có sự cảm ứng tạo rễ từ cây măng tây,chiều cao cũng như số chồi đều không có sự chênh lệch lớn về kết quả(sự khác biệt không có ý nghĩavề mặt thống kê).Về mặt hình thái, ở tất cả các nồng độ đều có kích thước thân nhỏ và mảnh, thân có màu xanh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
46
Hình 4.3 Ảnh hưởng của NAA với các nồng độ 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l lên sự hình thành rễ từ mẫu cấy chồi in vitro
4.4 Ảnh hưởng của nước dừa và NAA lên sự hình thành rễ từ mẫu cấy chồi in vitro
Trong nuôi cấy mô và chọn giống cây trồng, mục đích cuối là tạo ra cây con giống khỏe mạnh và phát triển tốt. Quá trình cảm ứng tạo rễ cũng là một trong những quá trình chính để tạo ra được giống cây con, quá trình này thường ảnh hưởng của auxin và cytokinite với những nồng độ khác nhau tùy từng loài. Thường trong quá trình này hàm lượng auxin sử dụng thường cao hơn. Thí nghiệm này thức hiện kết hợp giữa nước dừa và các nồng độ auxin khác nhau để cảm ứng hình thành mô sẹo.
Bảng 4.4Ảnh hưởng của nước dừa và NAA lên sự hình thành rễ từ mẫu cấy chồi in vitro
Nước dừa (ml/l) Nồng độ NAA ( mg/l) Chiều cao (cm) Số chồi
20 20 20 20 20 20 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 1,36a 1,25a 4,63c 5,12b 7,26e 6,30d 1.00a 1,00a 1.74b 3,20c 2,10e 2,00d
47
Hình 4.4Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa và NAA lên sự hình thành rễ từ mẫu cấy chồi
in vitro
A. Nồng độ NAA bổ sung là , mg l và 2 ml l nước dừa.
B. Nồng độ NAA bổ sung là ,5 mg l và 2 ml l nước dừa.
C. Nồng độ NAA bổ sung là 1, mg l và 2 ml l nước dừa.
D. Nồng độ NAA bổ sung là 1,5 mg l và 2 ml l nước dừa.
E. Nồng độ NAA bổ sung là 2, mg l và 2 ml l nước dừa.
F. Nồng độ NAA bổ sung là 3, mg l và 2 ml l nước dừa.
Theo dõi trong 4 tuần ta thấy ở tất cả các bình không có cảm ứng hình thành rễ, số lượng chồi hình thành ở các nghiệm thức cũng không cao, khoảng từ 1 – 3 chồi, tuy nhiên có sự chênh lệch về chiều cao ở các nghiệm thức, ở nghiệm thức bổ sung ; ,5 mg l NAA thì chiều cao của các chồi tương đối thấy trong khí ở nghiệm thức bổ sung 2, ; 3, mg l NAA thì chiều cao lại khá cao.
Công bố đầu tiên về việc sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô được nhà khoa học Van Overbeek và cộng sự của ông tìm ra. Sau đó thì tác dụng tích cực của nước dừa đã được nhiều nhà khoa học khác chứng nhận. Nước dừa là hợp chất tự nhiên chứa nhiều chất khoáng, vitamin, hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin có tác dụng kích