các giai đoạn phát triển trái
2.2.3.1. Li trích và cô lập
- Li trích
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong trái nhãn Tiêu da bò (trái non ở các giai đoạn khác nhau và trái khi thu hoạch) được li trích và phân đoạn trong phòng tối với ánh sáng đỏ, có quạt hút thông khí theo Nguyễn Du Sanh và cs (2013); Bùi Trang Việt (2000).
Nghiền 10 g vật liệu tươi trong 50 ml methanol 80% để trong tối 24 giờ, thỉnh thoảng lắc. Lọc thu dịch lọc I. Thêm vào bã 20 ml methanol 80%, lắc 20 phút. Lọc thu lấy dịch lọc II. Lặp lại một lần nữa thu dịch lọc III. Hòa chung dịch lọc I, II, III sau đó cô cạn dịch lọc này còn 1 ml.
Tiếp tục li trích theo hình 2.3
- Sắc ký lớp mỏng
Phân ly các chất ly trích bằng phương pháp sắc ký trên bản mỏng silica gel F254 (20x20 cm) để phân tách các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Nguyễn Du Sanh và cs, 2013; Bùi Trang Việt, 2000).
Sử dụng micropipet chấm ether cô cạn và chất chuẩn cách mép 2 cm. Sau mỗi lần chấm, dùng máy sấy làm khô vị trí này và sau đó tiếp tục chấm cho đến khi hết dịch ether. Chấm các điểm tương tự với hỗn hợp chất chuẩn (khoảng 5 µl) gồm IAA, ABA, gibberellin và zeatin tinh khiết nồng độ 200 mg/l cho mỗi chất.
Đặt bản silica gel vào thùng sắc kí dùng dung môi di chuyển (Isopropanol :
Amon hydroxyd : H2O = 10 : 1 : 1 (v/v), nhiệt độ 30 - 32oC). Theo mao dẫn dung môi
sẽ di chuyển dọc trên bản mỏng sắc kí, tùy thuộc vào đặc tính hòa tan của các chất mà chúng sẽ được phân ly tại các vị trí khác nhau trên bản sắc kí. Khi mức dung môi cách
mép 1 cm thì sắc kí kết thúc. Lấy bản sắc kí ra khỏi thùng, dùng bút chì đánh dấu mực dung môi và làm khô bản sắc kí.
Hình 2.3. Li trích và phân đoạn chất điều hòa sinh trưởng thực vật
(Nguyễn Du Sanh và cs, 2013)
- Phát hiện và cô lập
Sử dụng đèn UV chiếu trên bản mỏng silica gel để phát hiện và xác định vị trí của IAA, ABA, gibberellin và zeatin trên bảng sắc kí. Các vị trí này tùy thuộc vào hệ dung môi di chuyển và nhiệt độ môi trường khai triển sắc kí.
Trong hệ dung môi trên gibberellin (Rf = 0,72 - 0,76), IAA (Rf = 0,57 - 0,71),
ABA (Rf = 0,78 - 0,85), zeatin (Rf = 0,92 - 0,96). Các chất chuẩn, hỗn hợp các chất
nội sinh sẽ được phát hiện và cô lập riêng bằng cách dùng dao lam cạo lấy các hạt silic ở từng vùng trên bản sắc kí vào các ống nghiệm nhỏ để chuẩn bị giải hấp.
Giúp cho các chất điều hòa sinh trưởng thực vật sau khi được cô lập vào các hạt silic trên bảng sắc kí có thể tách rời và hòa tan tốt trong dung môi.
Dung môi chuẩn bị cho quá trình giải hấp gồm có methanol : chloroform = 8 : 2 (v/v), sau đó cứ 100 ml hỗn hợp dung môi được thêm vào 3 ml dung dịch acid acetic. Trộn đều dung môi giải hấp này trước khi sử dụng.
Thêm 3 ml dung môi giải hấp vào ống nghiệm đã chứa các hạt silic ở trên và
vortex 3 phút. Li tâm với vận tốc 1.500 v/p (trong 3 phút). Dịch nổi sau hai lần giải
hấp của mỗi chất được cho vào đĩa Petri hoặc Erlen 100 ml và cô cạn, sau đó thêm 10 ml nước cất và dùng đũa thủy tinh khuấy đều để hòa tan hoàn toàn các chất vào dung dịch để chuẩn bị sinh trắc nghiệm.
2.2.3.2. Đo hoạt tính bằng các sinh trắc nghiệm
Hoạt tính của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được xác định thông qua sinh trắc nghiệm (Nguyễn Du Sanh và cs, 2013; Bùi Trang Việt, 2000).
- IAA và ABA được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa
L.). Diệp tiêu lúa sau khi gieo khoảng ba ngày (khi bao diệp tiêu chưa bị xé), diệp tiêu
cao 15 mm. Cắt diệp tiêu (trong phòng tối + ánh sáng đỏ): cắt bỏ một đoạn 5 mm ngọn
diệp tiêu, cắt bỏ gốc diệp tiêu về phía hạt và rút lá mầm ra khỏi diệp tiêu. Dùng dao cắt
chuyên biệt để tạo khúc cắt diệp tiêu dài bằng nhau (2 mm) cho vào hộp Petri chứa
nước cất. Dùng kẹp gắp ngẫu nhiên 10 khúc cắt diệp tiêu cho vào mỗi hộp Petri chứa dung dịch trích và dung dịch chuẩn, trong tối. Sau 24 giờ, đo sự sai biệt chiều dài khúc
cắt diệp tiêu lúa so với chuẩn sẽ xác định được hoạt tính tương đương IAA hay ABA.
- Gibberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca
sativa L.). Hạt xà lách ngâm trong tối 24 giờ tới khi rễ mầm vừa ra khỏi vỏ, gắp ngẫu
nhiên 10 hạt vào mỗi Erlen chứa dung dịch trích và dung dịch chuẩn, đậy Erlen bằng
giấy parafin và đặt trong phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục cường độ 3000 lux,
nhiệt độ 28 ± 2o C.
Sau 72 giờ xác định chiều cao trụ hạ diệp cây mầm xà lách bằng thước mm. Sự sai biệt về chiều cao trụ hạ diệp trong mỗi dung dịch so với chuẩn và các chất tinh khiết sẽ cho biết hoạt tính tương đương của gibberellin nội sinh.
- Zeatin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dưa chuột (Cucumis sativus L.).
Hạt dưa chuột ngâm nước trong tối (24 giờ) tới khi rễ mầm vừa chui ra khỏi vỏ khoảng
5 mm, lột bỏ vỏ cứng và phần bao hai tử diệp. Cắt rời hai tử diệp với rễ mầm, cho phần tử diệp vào nước cất.
Cân năm mảnh tử diệp bằng cân phân tích. Đặt theo thứ tự tử diệp lên lam (mặt
trong tử diệp úp xuống), đặt vào mỗi hộp Petri chứa dung dịch trích và dung dịch chuẩn. Đặt hộp Petri trong phòng tăng trưởng có ánh sáng liên tục cường độ 3000 lux nhiệt độ 28 ± 2o
C. Sau 48 giờ sự sai biệt trọng lượng tử diệp trước và sau khi thí nghiệm sẽ cho biết hoạt tính tương đương của zeatin nội sinh.