xƣơng ở ấu trùng cá chỉ bị tổn thƣơng ở cung xƣơng thần kinh – Phƣơng pháp Im cung thần kinh
3.3.1.1. Phương pháp Im cung thần kinh: tổng độ dài 15 cung xương thần kinh bên trái của 15 đốt sống đầu tiên làm đại diện cho chỉ số khoáng hóa Im của mỗi ấu trùng cá dòng c7, c9d1, d1
Quan sát hình ảnh nhuộm xƣơng bằng Alizarin Red ấu trùng cá 11dpf của các dòng c7, c9d1, d1 so với cá đối chứng, chúng tôi thấy sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng các dòng cá này thể hiện rõ nhất ở cung xƣơng thần kinh của 15 đốt sống đầu tiên của xƣơng cột sống (Hình 3.8). Do vậy, chúng tôi chọn đánh giá mức độ khoáng hóa hay mức độ tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá dựa trên chiều dài các xƣơng cung thần kinh của 15 đốt sống đầu tiên này. Trên hình ảnh chụp mặt bên của ấu trùng đƣợc nhuộm xƣơng với độ phóng đại 10x, chúng tôi đo độ dài của các cung thần kinh của 15 đốt sống đầu tiên. Tổng chiều dài của 15 cung xƣơng thần kinh đƣợc lấy làm đại diện gián tiếp cho chỉ số khoáng hóa Im (bone mineralization index) của ấu trùng.
54
Hay ∑
Trong đó, Lk là chiều dài cung thần kinh của mỗi đốt sống (với k = 1, 2,…,15). Nhƣ vậy, đối với một ấu trùng khi có chỉ số Im cao thì mức độ tổn thƣơng xƣơng của nó thấp và ngƣợc lại. Cụ thể, chúng tôi dùng phần mềm ImageJ để đo chiều dài các cung xƣơng thần kinh của ấu trùng cá nhƣ trình bày ở phần dƣới đây (Hình 3.8).
Hình 3.8: Hình ảnh đo chiều dài cung xƣơng thần kinh của ấu trùng cá 11 ngày tuổi bằng phần mềm ImageJ
(A): Hình ảnh chụp mặt bên trái 15 đốt sống đầu tiên của ấu trùng cá đối chứng (không mang gen chuyển Rankl) với mỗi đốt sống có thân đốt sống (ct) và cung thần kinh (na); (B): Hình ảnh 15 đốt sống đầu tiên của một ấu trùng cá rankl:HSE:CFP dòng c7 có kiểu hình loãng xương nhẹ (thân đốt sống còn nguyên vẹn, các cung thần kinh bị tổn thương hoặc mất); (A’, B’): Hình ảnh phóng đại của của một số đốt sống đại diện được đánh dấu trong khung màu trắng tương ứng ở Hình A, B trong đó có một số cung xương thần kinh được đo chiều dài bằng ImageJ: dùng phần mềm vẽ đường (màu vàng) trùng khít theo sát cung xương, chiều dài đường màu vàng là chiều dài cung thần kinh đo được, nếu cung thần kinh bị mất hết thì chiều dài được tính bằng 0 (hình ngôi sao màu trắng). Thước chuẩn: A, B: 0,31 mm; C, D: 0,082 mm
55
Quy trình thực hiện đo chiều dài các cung xƣơng thần kinh bằng phần mềm ImageJ đƣợc mô tả nhƣ sau:
Bƣớc 1: Mở hình ảnh nhuộm xƣơng mặt bên với độ phóng đại 10x của ấu trùng cá cần đo bằng phần mềm ImageJ, sau đó nhấn dấu “+” để phóng đại vị trí cần đo lên 200%.
Bƣớc 2: Sử dụng chức năng đƣờng gấp khúc “Segmented line” để có thể vẽ đƣợc đƣờng gấp khúc theo sát và chồng khít lên cung thần kinh cần đo thƣờng không là đƣờng thẳng (Hình 3.8). Chiều dài của đƣờng gấp khúc này chính là chiều dài của cung thần kinh cần đo (Hình 3.8 A’, B’).
Bƣớc 3: Tiếp tục vẽ và đo chiều dài 14 cung thần kinh của 14 đốt sống còn lại. Lặp lại phép đo 3 lần cho mỗi ấu trùng.
Bƣớc 4: Sau khi đã vẽ đƣợc đƣờng gấp khúc trùng khít cung xƣơng, mỗi đƣờng cong tƣơng ứng với mỗi cung thần kinh sẽ đƣợc lƣu lại trong ROI Manager cho phép đánh giá, sửa hoặc đo lại dễ dàng. Để hiện ROI Manager, trên thanh công cụ chọn Analysis → Tool → ROI Manager (Hình 3.9), hoặc nhấn phím “T” sau mỗi lần vẽ đoạn gấp khúc. Để lƣu lại mỗi ROI tƣơng ứng cho mỗi ấu trùng cá, chọn File → Save.
Chú ý: Để có đƣợc kết quả chiều dài mỗi cung xƣơng của mỗi ấu trùng, trong ROI Manager chọn Measure hoặc trên thanh công cụ chọn Analyze → Measure. Kết quả của mỗi ROI đƣợc hiển thị trong một bảng kết quả (Hình 3.9). Lƣu bảng kết quả đó bằng cách chọn File → Save.
Bƣớc 5: Tính tổng chiều dài các cung xƣơng thần kinh của 15 đốt sống đầu tiên của mỗi ấu trùng cá trong ba lần đo và lấy giá trị trung bình. Giá trị trung bình này là chỉ số khoáng hóa Im đại diện cho mức độ khoáng hóa của ấu trùng.
56
Hình 3.9: Giao diện phần mềm ImageJ với tính năng “Segmented Line” (A), ROI Manager (B) và bảng kết quả đo chiều dài cung xƣơng thần kinh (C)
Mỗi đốt sống của ấu trùng cá có hai cung xƣơng thần kinh ở hai bên phải và trái (Hình 3.10), vậy liệu rằng chúng tôi chỉ đo chiều dài cung thần kinh ở một bên phải hoặc trái của ấu trùng thì chỉ số khoáng hóa Im đƣợc tính từ số đo của một bên này có đại diện đƣợc cho cả ấu trùng hay không?
57
Hình 3.10: Phần cột sống ấu trùng cá medaka 11dpf nhuộm với Alizarin Red đƣợc chụp ở hai tƣ thế mặt bên trái và phải để đo độ dài cung thần kinh mỗi bên
Hình ảnh chụp mặt bên trái (A) và mặt bên phải (B) của 15 đốt sống đầu tiên của một ấu trùng cá đối chứng (không mang gen chuyển); Hình ảnh chụp mặt bên trái (C) và mặt bên phải (D) của 15 đốt sống đầu tiên của một ấu trùng cá chuyển gen rankl; (E): Hình ảnh cấu trúc điển hình của một đốt sống của ấu trùng cá 11 ngày tuổi gồm hai cung thần kinh (neural arch – na) ở hai bên trái và phải của thân đốt sống (centrum – ct).
Để trả lời câu hỏi trên, với mỗi dòng cá chúng tôi đã đo chiều dài của 15 cung thần kinh bên phải và bên trái của 15 đốt sống đầu tiên, từ ảnh chụp mặt bên phải và ảnh chụp mặt bên trái của mỗi ấu trùng (Hình 3.10) trên một số lƣợng lớn ấu trùng (n ≥ 30) để tính đƣợc các giá trị trung bình của Im bên phải và Im bên trái của ấu trùng mỗi dòng. Chúng tôi cũng làm tƣơng tự với ấu trùng cá đối chứng và làm so sánh thống kê t-Test cho giá trị Im trung bình giữa hai mặt trái và phải ở mỗi dòng cá và so sánh với đối chứng. Các kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.11.
58
Kết quả ở Hình 3.11 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giá trị trung bình của Im bên trái và Im bên phải của cá đối chứng và cá ở cả 3 dòng c7, c9d1 và d1. Điều này cho thấy Im đƣợc tính dựa trên chiều dài cung thần kinh của 15 đốt sống ở một bên phải hay trái của cột sống đều có thể đại diện cho chỉ số khoáng hóa của mỗi ấu trùng cá. Do thao tác chụp ảnh chụp mặt bên trái của ấu trùng cá dễ dàng hơn, chúng tôi chọn hình ảnh chụp mặt bên trái để đo chiều dài các xƣơng cung thần kinh bên trái của 15 đốt sống đầu tiên qua đó tính đƣợc Im của ấu trùng.
Tổng kết lại, chúng tôi tóm tắt phƣơng pháp đã xây dựng đƣợc để gián tiếp đo mức độ khoáng hóa hay tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá – từ đây đặt tên là “phƣơng pháp Im cung thần kinh” dựa vào chiều dài của các xƣơng cung thần kinh nhƣ sau:
1. Phƣơng pháp sử dụng hình ảnh với độ phóng đại 10x chụp mặt bên trái xƣơng đƣợc nhuộm bằng Alizarin Red của ấu trùng cá.
2. Dùng phần mềm ImageJ đo chiều dài cung xƣơng thần kinh của 15 đốt sống đầu tiên trên hình ảnh chụp xƣơng của mỗi ấu trùng, đo 3 lần cho mỗi cung xƣơng.
3. Mức độ khoáng hóa của mỗi ấu trùng đƣợc đại diện bởi chỉ số khoáng hóa Im là tổng chiều dài trung bình của 15 cung xƣơng thần kinh của 3 lần đo. Im càng cao thì ấu trùng bị tổn thƣơng xƣơng càng ít và ngƣợc lại.
3.3.1.2. Sự đồng đều về mức độ tổn thương xương của các ấu trùng cá cùng dòng của các dòng c7, c9d1, d1 được xác định bằng phương pháp Im cung thần kinh
Các dòng cá c7, c9d1, d1 đã đƣợc chúng tôi lai tách từ dòng cá
rankl:HSE:CFP ban đầu là những dòng có sự đồng đều di truyền với gen chuyển (đều là các dòng cá dị hợp tử có một đoạn chèn của gen chuyển trong hệ gen). Chúng tôi hy vọng sự đồng đều về di truyền/kiểu gen này sẽ mang đến sự đồng đều về kiểu hình loãng xƣơng của các cá thể cá trong cùng dòng, nghĩa là các ấu trùng cá cùng dòng có mức độ bị tổn thƣơng xƣơng khác nhau không có ý nghĩa thống kê.
59
Sự đồng đều về mức độ tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá trong mỗi dòng đã đƣợc thấy trên hình ảnh nhuộm xƣơng của chúng (xem mục 3.2.2), tuy nhiên hình ảnh chỉ có tính chất định tính nên chúng tôi dùng phƣơng pháp Im xây dựng đƣợc để định lƣợng và khẳng định sự đồng đều này. Đối với mỗi dòng cá chúng tôi lấy một số ấu trùng (n ≥ 30) đã đƣợc gây kiểu hình loãng xƣơng, đo và tính chỉ số khoáng hóa Im của mỗi ấu trùng theo phƣơng pháp Im đã mô tả ở trên. Để khẳng định mức độ khoáng hóa đồng đều giữa các ấu trùng cá mỗi dòng, chúng tôi sử dụng chỉ số Im đã tính đƣợc cho từng ấu trùng của dòng và kiểm tra bằng phép kiểm định thống kê Mann-Whitney (với mức ý nghĩa = 0,01). Giả thuyết H0 đƣợc đặt là “Chỉ số khoáng hóa của các cá thể của cùng dòng cá là nhƣ nhau”. Khi đó, giá trị U tính đƣợc đƣợc so sánh với giá trị U tiêu chuẩn (Utc), nếu giá trị của U nhỏ hơn Utc thì giả thuyết H0 đƣợc chấp nhận, tức là sự khác nhau của các chỉ số khoáng hóa Im của các ấu trùng cá cùng dòng là không có ý nghĩa thống kê hay các ấu trùng này có mức độ khoáng hóa xƣơng giống và đồng đều nhau. Chúng tôi đã thực hiện những phân tích này cho ấu trùng cá các dòng c7, c9d1, d1 và kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.6. Bảng 3.6: Giá trị U và Utc của các dòng cá c7, c9 và d1 Dòng cá U Utc (=0,01) Số lƣợng ấu trùng (n) c7 0,585 2,58 [1] 38 c9d1 0,742 2,58 [1] 35 d1 1,926 2,58 [1] 34
Kết quả Bảng 3.6 cho thấy các giá trị U của cả 3 dòng cá c7, c9d1, d1 đều nhỏ hơn Utc tƣơng ứng của nó nên có thể kết luận là ở cả 3 dòng cá này, mức độ xƣơng khoáng hóa hay mức độ tổn thƣơng xƣơng của các cá thể cá cùng dòng là nhƣ nhau. Để có thể dùng các dòng lai tách đƣợc làm mô hình đánh giá tác dụng của hoạt chất, sự đồng đều về mức độ tổn thƣơng xƣơng của các ấu trùng cá mỗi dòng là rất quan
60
trọng nên đây là kết quả khẳng định giúp chúng tôi dùng các dòng cá này cho nghiên cứu tiếp theo.
3.3.1.3. Mức độ tổn thương xương của ba dòng cá c7, c9d1, d1 được xác định bằng phương pháp Im cung thần kinh
Sử dụng phƣơng pháp Im cung thần kinh xây dựng đƣợc ở trên, chúng tôi đã đo và tính đƣợc chỉ số khoáng hóa Im trung bình của các nhóm ấu trùng cá (n > 30) thuộc các dòng c7, c9d1, d1 và cá đối chứng lúc 11 ngày tuổi nhƣ trình bày ở Hình 3.11. Qua đây, chúng tôi thấy ấu trùng cá mỗi dòng đều có chỉ số Im trung bình thấp hơn đáng kể (với mức ý nghĩa thống kê p < 0,0001) so với chỉ số này của cá đối chứng tƣơng ứng, thể hiện sự tổn thƣơng xƣơng cung thần kinh của chúng nhƣ đã quan sát đƣợc trên hình ảnh.
Hình 3.11: Chỉ số khoáng hóa Im của các dòng cá đƣợc đo và tính dựa theo phƣơng pháp Im ((*) p < 0,0001)
Với mỗi dòng cá có 2 giá trị Im trung bình được tính: một giá trị được tính dựa trên chiều dài của cung thần kinh mặt bên trái (Im mặt trái) của ấu trùng, giá trị kia được tính dựa trên chiều dài của cung thần kinh mặt bên phải (Im mặt phải). Hai giá trị này khác nhau không có ý nghĩa thống kê ở cả 3 dòng cá c7, c9d1 và d1 nên Im mặt trái được lấy làm chỉ
61
số khoáng hóa đại diện cho mỗi dòng. Dòng cá đối chứng (ĐC) chỉ thể hiện Im mặt trái làm đại diện. n: số ấu trùng cá của mỗi dòng.
Từ các chỉ số khoáng hóa Im để xác định mức độ tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá mỗi dòng và so sánh mức độ tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá giữa các dòng, chúng tôi dùng chỉ số tổn thƣơng H (%) đại diện cho số phần trăm lƣợng xƣơng bị mất ở ấu trùng cá mỗi dòng so với cá đối chứng, đƣợc tính bằng công thức sau:
Từ công thức này, chúng tôi tính đƣợc các chỉ số tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá các dòng c7, c9d1 và d1 đƣợc thể hiện bởi biểu đồ ở Hình 3.12.
62
Qua biểu đồ ở Hình 3.12, chúng tôi khẳng định sự tổn thƣơng xƣơng cá ở 3 dòng c7, c9d1 và d1 thể hiện ở ba mức độ khác nhau, từ thấp đến cao là c7 (61,06%) < c9d1 (84,77%) < d1 (98,03%), nhƣ chúng tôi đã quan sát đƣợc trên hình ảnh (xem Hình 3.7). Với các con số đƣợc tính theo cách này chúng tôi có thể định lƣợng và so sánh đƣợc mức độ tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá các dòng. Chúng tôi cũng có thể tính đƣợc dòng cá c9d1 bị tổn thƣơng xƣơng gấp khoảng 2,6 lần dòng c7, dòng d1 bị tổn thƣơng xƣơng gấp khoảng 19,7 lần dòng c7 và gấp 7,7 lần dòng c9d1. Cùng với kết quả phân tích mức độ biểu hiện CFP của các dòng cá này (xếp từ thấp đến cao là c7 < c9d1 < d1, xem mục 3.2.1), chúng tôi thấy mức độ tổn thƣơng xƣơng của cá ở mỗi dòng có mối tƣơng quan thuận với mức độ biểu hiện CFP. Dòng cá c7 biểu hiện CFP yếu nhất cũng có mức độ tổn thƣơng xƣơng nhẹ nhất, dòng d1 biểu hiện CFP mạnh nhất cũng có mức độ tổn thƣơng bị tổn thƣơng xƣơng cung thần kinh nặng nhất trong 3 dòng cá này. Điều này có ý nghĩa thực tế trong sàng lọc phân loại cá chuyển gen với việc dùng mức độ biểu hiện CFP nhƣ dấu hiệu để dự đoán đƣợc mức độ tổn thƣơng xƣơng hay kiểu hình loãng xƣơng của nó.
3.3.2. Phƣơng pháp định lƣợng gián tiếp mức độ khoáng hóa và tổn thƣơng xƣơng ở ấu trùng cá bị tổn thƣơng thân đốt sống – Phƣơng pháp Im thân đốt xƣơng ở ấu trùng cá bị tổn thƣơng thân đốt sống – Phƣơng pháp Im thân đốt sống
3.3.2.1. Phương pháp Im thân đốt sống: tổng diện tích xương khoáng hóa ở mặt bên trái của thân 15 đốt sống đầu tiên đại diện cho chỉ số khoáng hóa Im của ấu trùng
Ấu trùng cá dòng d4d1 có kiểu hình loãng xƣơng nặng, không chỉ có các cung xƣơng thần kinh bị phá hủy hoàn toàn mà thân đốt sống cũng bị tổn thƣơng nghiêm trọng (thấy rõ nhất ở đốt sống 1-15 (phần Phụ lục 07), thể hiện bởi các vùng màu nền của ảnh không bắt màu thuốc nhuộm Alizarin Red, đƣợc chỉ bằng đầu mũi tên màu đỏ ở Hình 3.6). Do đó, chúng tôi chọn giá trị diện tích xƣơng khoáng hóa ở thân đốt sống của 15 đốt sống đầu tiên của mỗi ấu trùng cá là đại diện cho mức độ
63
khoáng hóa của nó gọi là chỉ số khoáng hóa Im. Chúng tôi xây dựng phƣơng pháp đặt tên là “Phƣơng pháp Im thân đốt sống” nhƣ trình bày ở phần dƣới đây.
Để xác định đƣợc mức độ khoáng hóa xƣơng ấu trùng cá đối chứng và mức độ tổn thƣơng xƣơng cá dòng d4d1 hay cá bị tổn thƣơng thân đốt sống, chúng tôi đo các diện tích sau bằng phần mềm ImageJ trên hình ảnh có độ phóng đại 10x chụp mặt bên của ấu trùng cá:
Diện tích bao quanh mỗi đốt sống gọi là tổng diện tích đốt sống (kí hiệu là S) (Hình 3.13A’)
Diện tích xƣơng khoáng hóa của mỗi đốt sống (phần bắt màu tím đỏ với thuốc nhuộm) chƣa bị phá hủy (kí hiệu là Sm) (Hình 3.13B’)
Chỉ số khoáng hóa Im của mỗi ấu trùng cá là tổng diện tích xƣơng khoáng hóa đo đƣợc của 15 đốt sống đầu tiên của nó:
64
Hình 3.13: Các diện tích xƣơng khoáng hóa ở thân đốt sống đƣợc đo bằng phần mềm ImageJ trên hình ảnh chụp mặt bên với độ phóng đại 10x của 15 đốt sống đầu của cột
sống ấu trùng cá đối chứng và cá dòng d4d1 đƣợc nhuộm với Alizarin Red
(A): Hình ảnh chụp mặt bên trái 15 đốt sống đầu tiên của ấu trùng cá đối chứng (không mang gen chuyển rankl) với mỗi đốt sống có thân đốt sống (ct) và cung thần kinh (na); (B): Hình ảnh 15 đốt sống đầu tiên của một ấu trùng cá dòng d4d1 bị mất hoàn toàn các cung xương thần kinh, thân đốt sống bị tổn thương nghiêm trọng); (A’, B’): Hình ảnh