Kiểu hình giống loãng xƣơng ở cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP có thể đƣợc tạo ra bằng cách sốc nhiệt phôi cá 9 ngày tuổi ở 39ºC trong 2 giờ [78]. Để phân tích kiểu hình loãng xƣơng đƣợc cảm ứng ở bốn dòng cá dị hợp tử c7, c9d1, d1, d4d1, chúng tôi đã sốc nhiệt đồng thời ấu trùng cá của bốn dòng này vào 9dpf, sau hai ngày, vào 11dpf nhuộm xƣơng bằng thuốc nhuộm Alizarin Red để phân tích sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá. Đồng thời, chúng tôi cũng tiến hành thí nghiệm tƣơng tự với phôi của cá đối chứng là cá không mang gen chuyển thu đƣợc khi sàng lọc cá chuyển gen. Trên hình ảnh chụp ấu trùng cá đã nhuộm xƣơng, mô xƣơng đang đƣợc khoáng hóa của nó bắt màu thuốc nhuộm Alizarin Red màu tím đỏ, các vùng xƣơng bị tổn thƣơng không bắt màu thuốc nhuộm tạo khoảng trống với màu nền của ảnh. Sự khoáng hóa xƣơng ở ấu trùng cá đối chứng và sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá của bốn dòng c7, c9d1, d1, d4d1 khi cá 11 ngày tuổi đƣợc trình bày ở các phần tiếp theo.
3.2.2.1. Sự khoáng hóa xương của ấu trùng cá đối chứng 11 ngày tuổi
Cấu trúc bộ xƣơng của cá medaka gồm 3 phần: xƣơng đầu, xƣơng cột sống và xƣơng vây. Một trong những ƣu điểm của cá medaka là các cấu trúc xƣơng phát triển khá nhanh, đặc biệt là xƣơng cột sống [2, 3]. Ở cá trƣởng thành có khoảng 30 đốt sống [41], mỗi đốt sống có cấu trúc gồm xƣơng cung thần kinh (neural arch – na), xƣơng cung mạch máu (hermal arch – ha) và xƣơng thân đốt sống (centrum – ct) [3]. Ở giai đoạn 10 ngày tuổi, phần đầu của ấu trùng cá medaka đã xuất hiện hầu hết những xƣơng cơ bản nhƣ: xƣơng lỗ tai (otolith – ot), xƣơng gốc bƣớm (paraspheroid – ps), xƣơng đỡ nắp mang (cleithrum – cl), xƣơng nắp mang (operculum – op), xƣơng răng (dentary – den), các xƣơng ở gần cổ (pharyngeal jaw,
44
basilar plate, supraoccipital); phần cột sống bao gồm khoảng 27 đốt sống đã đƣợc khoáng hóa chỉ còn khoảng 2-3 đốt cuối phía đuôi vẫn đang tiếp tục đƣợc khoáng hóa, mặc dù xƣơng cung thần kinh đã hình thành ở 6-7 đốt sống đầu tiên nhƣng xƣơng cung mạch máu vẫn chƣa xuất hiện; các tia vây đuôi đã hóa xƣơng và trở nên rõ ràng [2]. So với cá 10dpf, các cấu trúc xƣơng của ấu trùng cá 11dpf không có sự thay đổi nhiều, điều đáng chú ý ở thời điểm này là cột sống đã có khoảng 27-29 đốt sống và xƣơng cung thần kinh đã xuất hiện ở 18-20 đốt sống kể từ phía đầu (Hình 3.2).
Hình 3.2: Sự khoáng hóa xƣơng của ấu trùng cá đối chứng 11 ngày tuổi
(A) Cấu trúc xương khoáng hóa của cá đối chứng ở 11 ngày tuổi, sb = 0,58 mm. (B) Hình ảnh một số cấu trúc xương đặc trưng ở phần đầu như xương gốc bướm (parasphenoid – ps), xương nắp mang (operculum – op), branchiostegay rays (br), anterior basicranial commissure (abc), xương răng (dentary – den), hyosymplectic (hys). (C) Hình ảnh phóng đại một phần đốt sống từ ô vuông ở hình A cho thấy cấu trúc thân đốt sống (mũi tên màu trắng), cung thần kinh (đầu mũi tên màu trắng. Thước chuẩn: 0.089 mm
45
3.2.2.2. Sự tổn thương xương của ấu trùng cá dòng c7
Hình ảnh nhuộm xƣơng của ấu trùng cá dòng c7 vào 11 ngày tuổi, hai ngày sau khi ấu trùng bị sốc nhiệt cho thấy sự tổn thƣơng ở một số cấu trúc xƣơng khoáng hóa (Hình 3.3). Ở phần xƣơng đầu của ấu trùng, chúng tôi chỉ thấy xƣơng đỡ nắp mang (cleithrum – cl) bị đứt gãy, mất một phần hoặc bị mảnh hơn ban đầu (Hình 1 phần Phụ lục 03) trong khi hầu hết các cấu trúc xƣơng còn lại không bị tổn thƣơng. Tuy nhiên, sự tổn thƣơng xƣơng đƣợc thấy rất rõ ở xƣơng cột sống với sự mất đi một phần của các xƣơng cung thần kinh ở các đốt sống phần đầu (Hình 3.3, đầu mũi tên màu đỏ trong B’, C’, D’) và mất gần nhƣ hoàn toàn các xƣơng cung thần kinh của các đốt sống phía sau (Hình 3.3, đầu mũi tên màu đen), mặc dù thân các đốt sống còn nguyên vẹn (Hình 3.3, mũi tên màu trắng ở B’, C’, D’). Sự tổn thƣơng này đƣợc quan sát thấy đồng đều ở các phôi cá thu từ dòng c7 (Hình 3.3 B’, C’, D’).
Hình 3.3: Sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá dòng c7 11 ngày tuổi
(A) Hình ảnh các cấu trúc xương nguyên vẹn của ấu trùng cá đối chứng. (B, C, D) Hình ảnh các cấu trúc xương của 3 ấu trùng cá dòng c7. (A’) Hình ảnh phóng đại vùng cột sống của ấu trùng cá đối chứng trong ô ở Hình A cho thấy cột sống còn nguyên vẹn với mỗi đốt sống bao gồm cung xương thần kinh (chỉ bằng đầu mũi tên màu trắng) và thân đốt sống (chỉ bằng mũi tên màu trắng). (B’, C’, D’) Hình ảnh phóng đại của vùng cột sống trong ô
46
tương ứng ở hình B, C, D của các ấu trùng cá dòng c7, cho thấy sự tổn thương một phần (đầu mũi tên màu đỏ) hay bị mất hoàn toàn (đầu mũi tên màu đen) của các cung xương thần kinh. Thước chuẩn: A, B, C, D: 0,92 mm; A’, B’, C’, D’: 0,37 mm.
3.2.2.3. Sự tổn thương xương của ấu trùng cá dòng c9d1
Hình ảnh nhuộm xƣơng của ấu trùng cá dòng c9d1 cũng cho thấy sự tổn thƣơng xƣơng khoáng hóa đồng đều giữa các cá thể cùng dòng này. Ở phần xƣơng đầu chỉ có xƣơng đỡ nắp mang (cleithrum – cl) bị đứt gãy (Hình 1 phần Phụ lục 03), xƣơng gốc bƣớm (paraspheroid – ps) cũng mảnh hơn (Hình 2 phần Phụ lục 03); xƣơng cột sống có các cấu trúc thân đốt sống còn nguyên vẹn (chỉ bằng mũi tên màu trắng Hình 3.4 B’, C’, D’) nhƣng các xƣơng cung thần kinh bị tổn thƣơng (Hình 3.4). Mức độ tổn thƣơng xƣơng khoáng hóa ở ấu trùng cá dòng c9d1 theo chúng tôi quan sát đƣợc là mạnh hơn so với mức độ này của ấu trùng dòng c7. Ấu trùng dòng c9d1 chỉ có một vài đốt sống ở phần đầu còn sót lại dấu vết của cung thần kinh (chỉ bằng đầu mũi tên màu đỏ Hình 3.4 B’, C’, D’) còn những cung thần kinh của các đốt sống phần sau bị phá hủy hoàn toàn (chỉ bằng đầu mũi tên màu đen Hình 3.4 B’, C’, D’).
Hình 3.4: Sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá dòng c9d1 11 ngày tuổi
(A) Hình ảnh các cấu trúc xương nguyên vẹn của ấu trùng cá đối chứng. (B, C, D) Hình ảnh các cấu trúc xương của 3 ấu trùng cá dòng c9d1. (A’) Hình ảnh phóng đại vùng cột
47
sống của ấu trùng cá đối chứng trong ô ở Hình A cho thấy cột sống còn nguyên vẹn với mỗi đốt sống bao gồm cung xương thần kinh (chỉ bằng đầu mũi tên màu trắng) và thân đốt sống (chỉ bằng mũi tên màu trắng). (B’, C’, D’) Hình ảnh phóng đại của vùng cột sống trong ô tương ứng ở hình B, C, D của các ấu trùng cá dòng c9d1, cho thấy sự tổn thương một phần (đầu mũi tên màu đỏ) hay bị mất hoàn toàn (đầu mũi tên màu đen) của các cung xương thần kinh. Thước chuẩn: A, B, C, D: 0,92 mm; A’, B’, C’, D’: 0,37 mm.
3.2.2.4. Sự tổn thương xương của ấu trùng cá dòng d1
Ấu trùng cá dòng d1 đƣợc kích thích hủy xƣơng ở 9dpf và quan sát kiểu hình sau hai ngày khi đƣợc nhuộm với Alizarin Red cho thấy mức độ hủy khoáng hóa xƣơng đồng đều giữa các cá thể (Hình 3.5). Các cấu trúc xƣơng phần đầu của dòng cá này vẫn nguyên vẹn, chỉ có xƣơng gốc bƣớm (paraspheroid – ps) mảnh hơn (Hình 2 phần Phụ lục 03) và xƣơng đỡ nắp mang (cleithrum – cl) bị đứt gãy hoặc mất một phần (Hình 1 phần Phụ lục 03). Sự tổn thƣơng xƣơng khoáng hóa xảy ra rõ nhất ở phần cột sống với các đốt sống có các xƣơng cung thần kinh bị phá hủy gần nhƣ hoàn toàn (chỉ bởi mũi tên màu trắng hình 3.5 B’, C’, D’) nhƣng các thân đốt sống còn nguyên vẹn. Chỉ có một số đốt sống phía sau của một số ít ấu trùng dòng cá này vẫn còn gốc cung thần kinh rất ngắn (chỉ bởi đầu mũi tên màu đỏ Hình 3.5C’).
48
Hình 3.5: Sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá dòng d1 11 ngày tuổi
(A) Hình ảnh các cấu trúc xương nguyên vẹn của ấu trùng cá đối chứng. (B, C, D) Hình ảnh các cấu trúc xương của 3 ấu trùng cá dòng d1. (A’) Hình ảnh phóng đại vùng cột sống của ấu trùng cá đối chứng trong ô ở Hình A cho thấy cột sống còn nguyên vẹn với mỗi đốt sống bao gồm cung xương thần kinh (chỉ bằng đầu mũi tên màu trắng) và thân đốt sống (chỉ bằng mũi tên màu trắng). (B’, C’, D’) Hình ảnh phóng đại của vùng cột sống trong ô tương ứng ở hình B, C, D của các ấu trùng cá dòng d1, cho thấy sự tổn thương gần hết (đầu mũi tên màu đỏ) hay bị mất hoàn toàn (đầu mũi tên màu đen) của các cung xương thần kinh. Thước chuẩn: A, B, C, D: 0,92 mm; A’, B’, C’, D’: 0,37 mm.
3.2.2.5. Sự tổn thương xương của ấu trùng cá dòng d4d1
Ấu trùng cá dòng d4d1 bị tổn thƣơng xƣơng rất mạnh. Hình ảnh nhuộm xƣơng ấu trùng 11 ngày tuổi sau hai ngày sốc nhiệt cho thấy, ở phần đầu có xƣơng đỡ nắp mang (cleithrum – cl) bị mất gần hết và xƣơng gốc bƣớm (paraspheroid – ps) bị mảnh hơn nhiều so với cá đối chứng (Phụ lục 03). Điều đáng chú ý là, xƣơng cột sống của những ấu trùng dòng cá này bị tổn thƣơng nghiêm trọng với những đốt sống có các cung thần kinh bị phá hủy toàn bộ (chỉ bởi đầu mũi tên màu đen Hình 3.6 B’, C’, D’) và thân đốt sống cũng bị phá hủy rất nặng (đƣợc chỉ bởi mũi tên màu đỏ trong Hình 3.6 B’, C’, D’)
49
Hình 3.6: Sự tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng cá dòng d4d1 11 ngày tuổi
(A) Hình ảnh các cấu trúc xương nguyên vẹn của ấu trùng cá đối chứng. (B, C, D) Hình ảnh các cấu trúc xương của 3 ấu trùng cá dòng d4d1. (A’) Hình ảnh phóng đại vùng cột của ấu trùng cá đối chứng trong ô ở Hình A cho thấy cột sống còn nguyên vẹn với mỗi đốt sống bao gồm cung xương thần kinh (chỉ bằng đầu mũi tên màu trắng) và thân đốt sống (chỉ bằng mũi tên màu trắng). (B’, C’, D’) Hình ảnh phóng đại của vùng cột sống trong ô tương ứng ở hình B, C, D của các ấu trùng cá dòng d4d1, cho thấy các cung xương thần kinh bị mất hoàn toàn (đầu mũi tên màu đen), vùng thân đốt sống bị tổn thương nặng (mũi tên màu đỏ). Thước chuẩn: A, B, C, D: 0,92 mm; A’, B’, C’, D’: 0,37 mm.
3.2.2.6. So sánh kiểu hình giống loãng xương của bốn dòng cá c7, c9d1, d1, d4d1
Quan sát và phân tích hình ảnh nhuộm xƣơng của ấu trùng cá 11 ngày tuổi của bốn dòng cá tách đƣợc sau khi đã đƣợc gây kiểu hình giống loãng xƣơng bằng sốc nhiệt, chúng tôi đánh giá và xếp loại mức độ tổn thƣơng trên xƣơng cột sống của các dòng cá này từ nhẹ đến nặng là nhƣ sau: c7 < c9d1 < d1 < d4d1 (Hình 3.7). Ấu trùng cá dòng c7 và c9d1 có sự tổn thƣơng xƣơng ở mức độ nhẹ, tuy nhiên, dòng c9d1 có mức độ tổn thƣơng các cung xƣơng thần kinh mạnh hơn dòng c7 thể hiện ở nhiều đốt sống bị mất hoàn toàn và một số các đốt sống phần đầu chỉ còn một chút dấu vết cung xƣơng này (đầu mũi tên màu đỏ Hình 3.7 B, C). Ấu trùng cá dòng d1 có mức độ tổn thƣơng xƣơng trung bình với sự phá hủy hoàn toàn của các cung xƣơng thần kinh, chỉ một số ít ấu trùng cá của dòng này vẫn còn gốc cung thần kinh
50
rất ngắn (đầu mũi tên màu đỏ Hình 3.7D). Dòng d4d1 bị tổn thƣơng xƣơng mạnh nhất thấy rõ không chỉ ở sự mất hết các cung thần kinh mà còn ở sự tổn thƣơng nghiêm trọng ở phần thân của các đốt sống (mũi tên màu đỏ Hình 3.7E). Mức độ tổn thƣơng xƣơng của ấu trùng các dòng cá này đã đƣợc chúng tôi định lƣợng và khẳng định bằng phƣơng pháp xác định chỉ số khoáng hóa của ấu trùng mà chúng tôi đã xây dựng đƣợc và trình bày ở các mục 3.4.1.2, 3.4.1.3, và 3.4.2.2.
51
Hình 3.7: So sánh kiểu hình loãng xƣơng của bốn dòng cá c7, c9d1, d1, d4d1
Hình ảnh nhuộm xương cột sống của ấu trùng cá đối chứng (Hình A) và ấu trùng cá đại diện cho mỗi dòng c7, c9d1, d1, d4d1 được xếp theo mức độ tổn thương xương tăng dần từ trên xuống dưới tương ứng với các Hình B, C, D, E. Đầu mũi tên màu trắng chỉ đại diện cung xương thần kinh còn nguyên vẹn, đầu mũi tên màu đỏ chỉ đại diện cung xương thần
52
kinh bị mất một phần, đầu mũi tên màu đen chỉ đại diện gốc cung thần kinh bị mất hết, mũi tên màu trắng chỉ đại diện thân đốt sống còn nguyên vẹn, mũi tên màu đỏ chỉ thân đốt sống bị tổn thương.