Chúng tôi thực hiện đề tài “Tách dòng và đánh giá mức độ khoáng hóa xƣơng của cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP” với hai mục tiêu chính:
1. Tách dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu thành một số dòng cá, mỗi dòng gồm các cá thể có tính di truyền với gen chuyển và mức độ tổn thƣơng xƣơng đồng nhất.
2. Xây dựng phƣơng pháp đánh giá mức độ khoáng hóa xƣơng của ấu trùng cá medaka qua đó đánh giá đƣợc mức độ tổn thƣơng xƣơng trên cá
20
Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nghiên cứu của chúng tôi thực hiện trên dòng cá medaka chuyển gen
rankl:HSE:CFP và cá chủng dại. Phôi của dòng cá này đƣợc cung cấp bởi ĐHQG Singapo, đã đƣợc nuôi và duy trì tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh lý học và Sinh học ngƣời, Khoa Sinh học từ tháng 3 năm 2013.
2.2. Thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
Nghiên cứu của chúng tôi dùng các dụng cụ, thiết bị với mục đích sử dụng nhƣ trình bày trong bảng dƣới đây:
Bảng 2.1: Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị, dụng cụ Hãng sản xuất Mục đích sử dụng
Khay nhựa kích thƣớc 24cm x 15cm x 7cm (2,5L)
Song long Nuôi ấu trùng cá sau khi nở đƣợc 5-6 ngày Khay nhựa kích thƣớc 28cm x 18cm x 12cm (6L) Nuôi cá nhỏ Khay nhựa kích thƣớc 35cm x 22cm x 15cm (11,5L) Nuôi cá trƣởng thành
Đĩa Petri đƣờng kính 9cm Thu phôi cá
Xô nhựa Song long Phơi nƣớc nuôi cá
21
70cm x 40cm x 50cm nồng độ oxygen hòa tan
Vợt Thu trứng
Pipet nhựa Hút chất bẩn từ các khay
nuôi cá
Ống Falcon 15ml, 50ml BD Falcon Pha hóa chất
Pipet man 1000 μl, 200μl, 100 μl
Jencons sealpette Làm thí nghiệm
Lam kính Microscope slides Làm tiêu bản chụp ảnh
Lamen 22mm x 40 mm Microscope cover glasses Lamen 22mm x 22 mm Sail brand
Bộ kit soi huỳnh quang Sàng lọc phôi/ấu trùng cá
mang gen chuyển Kính hiển vi soi nổi Stemi DV4 Zeiss Soi mẫu và chụp ảnh
Kính hiển vi Axioplanz Zeiss
VMI0070
Máy ảnh Optika Chụp ảnh mẫu cố định
Điều hòa nhiệt độ Panasonic Duy trì nhiệt độ nuôi cá
ổn định
Bể ổn nhiệt Julabo Sốc nhiệt phôi/ấu trùng cá
medaka chuyển gen
rankl:HSE:CFP
Tủ ấm Memmert Duy trì nhiệt độ ổn định
cho phôi cá
22
Đèn ống, đèn led Rạng đông Tạo quang chu kỳ
Giá nuôi cá Làm giá đỡ các bể nuôi cá
2.2.2. Các phần mềm dùng trong nghiên cứu, viết luận văn
ImageJ IJ 1.46r: xử lý hình ảnh sau khi chụp (ghép ảnh, đo chiều dài và diện tích các xƣơng để xây dựng phƣơng pháp đánh giá mức độ khoáng hóa của ấu trùng cá)
Microsoft Paint windows 10: xử lý hình ảnh
Microsoft PowerPoint windows 10: xử lý hình ảnh
Endnote X6: quản lý tài liệu tham khảo
GraphPad Prism 6: phân tích thống kê, xử lý số liệu
2.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu
Các hóa chất và dung dịch đƣợc sử dụng cho nghiên cứu có nguồn gốc và đƣợc chuẩn bị nhƣ trình bày dƣới đây:
Bảng 2.2: Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Tên hóa chất Hãng sản
xuất
Dung dịch cần dùng từ hóa chất, cách pha
Mục đích sử dụng
PFA Sigma PFA 16%
Cách pha: từ 3,2g bột PFA + 20ml PBS 1x - Dung dịch gốc PFA 4% Cách pha: 100ml PFA 4% pha từ 25ml PFA 16% + 75ml H2O Cố định ấu trùng cá medaka nhỏ PBS Sigma PBS 10x - Dung dịch gốc
23 Cách pha: 3,2058g NaCl + 0,08g KCl + 0,46g Na2HPO4 + 0,08g KH2PO4 + 40ml H2O PBS 1x
Cách pha: pha từ dung dịch PBS 10x và H2O theo tỉ lệ 1:9 - Đệm pha PFA - Sử dụng trong quá trình nhuộm xƣơng Etanol Công ty cổ phần hóa dƣợc Việt Nam
Etanol 99% Pha dung dịch
nhuộm xƣơng
Etanol 70% Khử trùng
Etanol 50% Loại nƣớc sau khi
cố định bằng PFA H2O2 3% Công ty cổ phần hóa dƣợc Việt Nam H2O2 1,5% Cách pha: pha từ H2O2 3% và H2O theo tỉ lệ theo tỷ lệ 1:1 Tẩy tế bào sắc tố trong quá trình nhuộm xƣơng Glycerol Xilong chemical Glycerol 100% Sử dụng trong chụp ảnh sau khi nhuộm xƣơng Glycerol 50% Cách pha: pha từ Glycerol 100% và H2O theo tỉ lệ theo tỷ lệ 1:1
Rửa và bảo quản mẫu đã nhuộm xƣơng
KOH Sigma KOH 10%
Cách pha: pha từ 1g
Sử dụng trong quá trình nhuộm xƣơng
24
KOH + 10ml H2O Alizarin Red Sigma A5533 Alizarin Red 0,5%
Cách pha: 1,125g Alizarin Red thêm 25ml nƣớc cất, khuấy từ đến tan hết, lọc qua giấy lọc
Nhuộm xƣơng phôi/ấu trùng sau khi đã cố định bằng PFA Methylcellulose Sigma Dung dịch Methylcellulose 0,03% Làm giá giữ và xoay ấu trùng khi chụp ảnh
Nƣớc cất Rửa mẫu và pha
hóa chất
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phƣơng pháp nuôi và duy trì dòng cá medaka chuyển gen
rankl:HSE:CFP
2.4.1.1. Ánh sáng, nhiệt độ, nước nuôi cá
Cá đƣợc nuôi trong phòng thí nghiệm với chu kì sáng - tối là 14 giờ - 10 giờ, nhiệt độ phòng duy trì bằng điều hòa nhiệt độ đặt ở 28ºC, dao động trong khoảng 26-30ºC. Nguồn nƣớc nuôi cá đƣợc lấy từ hệ thống nƣớc sạch, phơi ít nhất một tuần cho bay khí Clo. Sau 2 tuần tiến hành thay nƣớc cho cá bằng cách rút bỏ 1/3 lƣợng nƣớc cũ, cặn bẩn dƣới đáy và loại bỏ bớt rêu tảo và bổ sung nƣớc mới thay thế.
Cá medaka trƣởng thành hơn ba tháng tuổi đƣợc nuôi trong những khay riêng, tách biệt với ấu trùng, vì chúng sẽ ăn những con ấu trùng cá nhỏ hơn. Thậm chí, ngay cả những con ấu trùng lớn hơn sẽ tấn công và ăn những con ấu trùng nhỏ hơn, vì vậy phải nuôi cá trong những khay khác nhau dựa trên kích thƣớc của con cá. Khoảng 6-8 cá medaka trƣởng thành đƣợc nuôi trong mỗi khay nhựa Song long 11,5 lít nƣớc, với tỉ lệ đực : cái khoảng 1:2. Mỗi khay cá có một thiết bị lọc nƣớc nhỏ để môi trƣờng nƣớc luôn trong sạch, tăng nồng độ oxi hòa tan. Có thể thêm vào
25
khay vài nhánh rong và một vài ốc nhỏ tạo hệ sinh cảnh nhỏ giúp điều hòa và cân bằng môi trƣờng nƣớc nuôi cá (Hình 2.1).
Đối với cá nhỏ hơn hai tháng tuổi, chúng tôi nuôi 13-15 con trong những khay nhỏ chứa 6 lít nƣớc, đƣợc làm sạch và hút hết cặn bẩn hàng ngày.Thay nƣớc 3 ngày 1 lần bằng cách rút ra 1/3 lƣợng nƣớc trong khay nuôi, sau đó bổ sung thêm nƣớc mới thay thế.
Phôi cá và cá con mới nở đến một tháng tuổi, đƣợc nuôi bằng nƣớc lọc thẩm thấu ngƣợc RO có bổ sung thêm muối nuôi cá với nồng độ 60mg/l. Để 20 phôi trong một đĩa petri nuôi trong tủ ấm và duy trì nhiệt độ ổn định trong tủ ở 28ºC. Các đĩa đƣợc ghi nhãn rõ ràng với tên dòng cá và ngày thu. Khoảng 5 ngày sau khi cá nở thành ấu trùng (vào khoảng 7 ngày tuổi), chuyển ấu trùng sang khay nhựa chứa 1,4 lít nƣớc. Khay hoặc đĩa petri bẩn đƣợc rửa sạch bằng nƣớc và ngâm trong cồn 70º từ 1 đến 2 ngày để hạn chế nhiễm nấm hay vi khuẩn gây bệnh. Mặc dù không dùng thiết bị lọc nƣớc cho ấu trùng và cá con nhƣng phải chăm sóc chúng kỹ lƣỡng hơn cá trƣởng thành. Hàng ngày hút chất bẩn và vệ sinh khay thƣờng xuyên để tránh tạo lớp váng bụi bẩn hoặc nấm phát triển trên bề mặt nƣớc, dễ gây bệnh hoặc thiếu oxi có thể làm cá chết.
26
2.4.1.2. Thức ăn cho cá và cách cho cá ăn
Chúng tôi sử dụng thức ăn chuyên dùng cho cá medaka của hãng Hikari, Nhật Bản (http://kyorin-net.co.jp/), có nhiều loại thức ăn đƣợc dùng phù hợp cho theo từng giai đoạn phát triển của cá (Bảng 2.3).
Bảng 2.3: Tỷ lệ dinh dƣỡng của thức ăn cho từng giai đoạn phát triển của cá
Protein Lipid Chất xơ Tro Phospho Độ ẩm Cá trƣởng thành ≥ 48% ≥ 5% ≤ 2% ≤ 16% ≥ 1,0% < 10% Cá con ≥ 48% ≥ 3% ≤ 2% ≤ 18% ≥ 1,36% < 10% Cá trƣởng thành cần kích thích đẻ trứng ≥ 51% ≥ 9% ≤ 2% ≥ 17% ≥ 1% < 10%
Cho cá ăn 3 lần/ngày vào khoảng 8:00, 12:00 và 17:00 hàng ngày. Cho cá ăn với một lƣợng vừa đủ để cá ăn hết thức ăn trong 3 phút, tránh cho quá nhiều sẽ làm nƣớc nhanh bẩn những cũng không nên cho cá ăn quá ít và phải cho cá ăn đúng giờ.
2.4.1.3. Phương pháp ghép cá đẻ và thu phôi cá
Để cá đẻ đều thì cần phải duy trì điều kiện nuôi cá và nguồn thức ăn ổn định. Cá đực và cá cái đƣợc nuôi chung trong cùng một bể với số lƣợng từ 10-20 cá thể trƣởng thành với tỷ lệ đực : cái là 1:2. Khác với cá zebrafish, cá medaka trƣởng thành thƣờng đẻ 20-30 trứng/ngày và trứng sau khi đẻ dính vào bụng mẹ trong khoảng 16-24 tiếng [42].
Cá bố mẹ có thể đƣợc tách riêng trƣớc ngày cần thu trứng, sau đó tiến hành ghép cá bố mẹ vào sáng hôm sau (7-9 giờ sáng), sau khi ghép khoảng 15-30 phút thì cá mẹ đẻ. Sau khi cá đẻ và quan sát trứng đã đƣợc thụ tinh, tiến hành thu trứng và cho vào dung dịch nƣớc muối nuôi phôi và loại bỏ những trứng không đƣợc thụ tinh.
27
2.4.1.4. Phương pháp nuôi phôi và chăm sóc cá con
Phôi cá đƣợc nuôi trong đĩa petri với dung dịch nƣớc muối nuôi cá nồng độ 60 mg/l. Sau 7-10 ngày tuổi, phôi nở thành ấu trùng cá, 5 ngày sau khi nở chuyển sang khay nuôi cá con và cho thức ăn của cá con.
Cá con đƣợc nuôi trong nƣớc lọc RO bổ sung muối biển và cho ăn 3 lần/ngày (xem mục 2.4.1.1 và 2.4.1.2)
2.4.2. Phƣơng pháp lai phân tách dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu
Dòng cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu đƣợc lai ngoại phối với cá chủng dại để phân tách gen chuyển vào các cá thể cá ở thế hệ F1. Những cá thể F1 tiếp tục đƣợc lai phân tích để kiểm tra kiểu gen của gen chuyển. Các cá thể cá mang gen chuyển đƣợc phát hiện và sàng lọc nhờ tín hiệu CFP quan sát đƣợc bằng bộ kit huỳnh quang (Hình 2.2). Phôi cá ở 1 ngày tuổi đƣợc sốc nhiệt ở 39ºC trong 30 phút và kiểm tra sự biểu hiện CFP vào ngày hôm sau. Nếu tỉ lệ số phôi mang gen chuyển : không mang gen chuyển ở thế hệ F2 là 1:1 thì cá thể F1 của nó có khả năng là cá dị hợp tử với một đoạn chèn của gen chuyển. Tỉ lệ số phôi mang gen chuyển (CFP+) : không mang gen chuyển (CFP-) đƣợc kiểm tra bằng kiểm định Khi bình phƣơng (Chi square test). Cá thể cá sẽ đƣợc khẳng định là dị hợp tử với một đoạn chèn của gen chuyển trong hệ gen sau khi lai phân tích qua 3 thế hệ của nó cho tỉ lệ CFP+ : CFP- là 1:1 và đƣợc dùng làm cá nguồn tạo các dòng cá có sự đồng đều về di truyền với gen chuyển.
2.4.3. Cách đặt tên cá cho các phép lai
Để quản lý dòng cá một cách hệ thống, chúng tôi đặt ra quy tắc đặt tên cho từng cá thể cá chuyển gen. Cá ban đầu đƣợc chọn để tiến hành lai phân tách đƣợc coi là thế hệ F0, con của cá F0 là thế hệ F1 và cứ tiếp tục nhƣ vậy đến thế hệ F2, F3... Thêm vào đó, từng cá thể cá sẽ đƣợc đặt tên theo giới tính (c: con cái, d: con đực) và số thứ tự (1, 2, 3…) mà cá thể đó đƣợc chọn để lai. Ví dụ, cá thể d1F0 là cá
28
đực rankl:HSE:CFP thứ nhất ở thế hệ F0; d1d1c3F2 là cá cái thứ ba ở thế hệ F2, là con của cá thể d1d1F1 (cá thể đực thứ nhất ở thế hệ F1 từ d1F0).
2.4.4. Phƣơng pháp sốc nhiệt
. Sốc nhiệt để sàng lọc phôi cá mang gen chuyển: Phôi cá 1 ngày tuổi đƣợc sốc nhiệt ở 39ºC trong 30 phút. Phôi sau khi đƣợc sốc nhiệt sẽ đƣợc sàng lọc dựa vào tín hiệu CFP bằng cách sử dụng kít soi huỳnh quang vào ngày hôm sau.
. Sốc nhiệt để kích thích kiểu hình loãng xương: Phôi cá 9 ngày tuổi đƣợc sốc nhiệt ở 39oC trong 2 giờ. Kiểu hình loãng xƣơng đƣợc phân tích vào thời điểm ấu trùng ở 11 ngày tuổi, hai ngày sau khi sốc nhiệt.
2.4.5. Phƣơng pháp nhuộm xƣơng ấu trùng cá
Mô xƣơng đã khoáng hóa đƣợc nhuộm bằng phƣơng pháp nhuộm xƣơng dùng Alizarin Red đã đƣợc sử dụng phổ biến [85]. Alizarin Red là chất nhuộm xƣơng điển hình do có ái lực cao với canxi, trong môi trƣờng nhuộm Alizarin Red sẽ bám vào các cấu trúc có thành phần canxi và cho màu tím đỏ đặc trƣng.
Quy trình nhuộm xƣơng:
Bước 1:Cố định mẫu. Phôi/ấu trùng cá medaka đƣợc cho vào các giếng của đĩa 24 giếng, hút hết nƣớc xung quanh rồi rửa bằng dung dịch PBS 1x. Ngay sau đó đƣợc cố định trong 1ml PFA 4% trong 2 giờ với đĩa đựng phôi cá đƣợc lắc ở nhiệt độ phòng. Sau đó hút bỏ PFA, rửa nhanh phôi cá bằng PBS 1x,và thêm vào mỗi giếng 1ml dung dịch ethanol 50% trong 10 phút để loại bớt nƣớc khỏi phôi cá.
Bước 2: Nhuộm. Hút bỏ dung dịch etanol 50% khỏi phôi cá, cho vào mỗi giếng 1ml dung dịch thuốc nhuộm xƣơng, lắc qua đêm ở điều kiện nhiệt độ phòng. Tùy vào số lƣợng mẫu nhuộm, thể tích dung dịch nhuộm phù hợp đƣợc pha từ các thành phần nhƣ sau:
29
Bảng 2.4: Thể tích pha dung dịch thuốc nhuộm xƣơng
thể tích hóa chất 1 ml 2 ml 4 ml 6 ml H2O 260 μl 520 μl 1040 μl 1560 μl Cồn 99% 730 μl 1460 μl 2920 μl 4380 μl Alizarin Red 0,5% 10 μl 20 μl 40 μl 60 μl
Bước 3: Tẩy sắc tố. Sau khi phôi/ấu trùng đã đƣợc nhuộm qua đêm, loại bỏ dung dịch nhuộm xƣơng và rửa nhanh phôi/ấu trùng với 1ml nƣớc cất rồi hút bỏ. Sau đó thêm vào 1ml dung dịch tẩy vào mỗi giếng và để trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch tẩy sắc tố là hỗn hợp gồm H2O2 1,5% và KOH 1% đƣợc pha từ H2O2 3% và KOH 2% theo tỉ lệ 1:1.
Bước 4: Làm sạch. Sau 20 phút tẩy sắc tố, mẫu đƣợc làm sạch những chỗ bắt màu không đặc hiệu bằng dung dịch chứa KOH. Pha dung dịch làm sạch gồm Glycerol 20% và KOH 0,25%, phụ thuộc vào thể tích dung dịch cần, dung dịch có thể đƣợc pha theo bảng dƣới đây:
Bảng 2.5: Thể tích pha dung dịch làm sạch thể tích hóa chất 1 ml 2 ml 4 ml 6 ml H2O 575 μl 1150 μl 2300 μl 3450 μl KOH 10% 25 μl 50 μl 100 μl 150 μl Glycerol 50% 400 μl 800 μl 1600 μl 2400 μl
Bước 5: Rửa. Hút bỏ dung dịch làm sạch và rửa lại bằng 1ml dung dịch Glycerol 50% và KOH 0,25% (mỗi ml Glycerol 50% thêm vào 25μl KOH 10%).
30
Bước 6: Bảo quản. Mẫu đã nhuộm đƣợc lƣu trữ trong dung dịch Glycerol 50% và dung dịch KOH 0,1% (mỗi ml glycerol thêm vào 10μl KOH 10%) ở 4oC.
2.4.6. Phƣơng pháp chụp ảnh và xử lý hình ảnh
Phương pháp chụp ảnh huỳnh quang CFP: Tín hiệu huỳnh quang CFP đƣợc dùng làm chỉ thị cho gen chuyển rankl:HSE:CFP ở phôi cá chuyển gen. Phôi chuyển gen đƣợc sàng lọc nhờ tín hiệu CFP bằng kít soi huỳnh quang đƣợc lắp đặt với kính soi nổi Zeiss, ảnh đƣợc chụp nhờ máy ảnh Optika B3 và phần mềm Optika View7.
Hình 2.2: Bộ kit huỳnh quang
(A) Kit soi huỳnh quang (Lumos Technology Co. LTD., Đài Loan): (1) bộ phận kích thích phát ra ánh sáng, (2) adaptor chuyển đổi điện, (3) tấm kính bảo vệ mắt, (4) kính lọc CFP 490 nm, (5) kính lọc GFP longpass. (B) Lắp bộ kít chụp ảnh huỳnh quang: (1) máy ảnh Optika B3, (2) kính soi nổi Zeiss Stemi 2000-C, (3) kit soi huỳnh quang.
Phương pháp chụp ảnh cá nhuộm xương: Ấu trùng cá đƣợc nhuộm xƣơng đƣợc đặt trên một lam kính có khoảng không gian (bề dày) đƣợc tạo ra bằng cách xếp chồng nhiều lamen ở hai bên (Hình 2.3) và chụp ảnh bằng máy ảnh Optika B3 nối với kính hiển vi Zeiss Axioplanz với độ phóng đại 2.5X và 10X.
31
Hình 2.3: Lam kính dùng để làm tiêu bản ấu trùng cá đã nhuộm xƣơng để chụp ảnh.
2.4.7. Phân tích thống kê
Nghiên cứu của chúng tôi đã sử dụng các phân tích thống kê sau:
Kiểm định Khi bình phƣơng (Chi square test): Dùng để kiểm tra tỉ lệ số phôi