Mô xƣơng đã khoáng hóa đƣợc nhuộm bằng phƣơng pháp nhuộm xƣơng dùng Alizarin Red đã đƣợc sử dụng phổ biến [85]. Alizarin Red là chất nhuộm xƣơng điển hình do có ái lực cao với canxi, trong môi trƣờng nhuộm Alizarin Red sẽ bám vào các cấu trúc có thành phần canxi và cho màu tím đỏ đặc trƣng.
Quy trình nhuộm xƣơng:
Bước 1:Cố định mẫu. Phôi/ấu trùng cá medaka đƣợc cho vào các giếng của đĩa 24 giếng, hút hết nƣớc xung quanh rồi rửa bằng dung dịch PBS 1x. Ngay sau đó đƣợc cố định trong 1ml PFA 4% trong 2 giờ với đĩa đựng phôi cá đƣợc lắc ở nhiệt độ phòng. Sau đó hút bỏ PFA, rửa nhanh phôi cá bằng PBS 1x,và thêm vào mỗi giếng 1ml dung dịch ethanol 50% trong 10 phút để loại bớt nƣớc khỏi phôi cá.
Bước 2: Nhuộm. Hút bỏ dung dịch etanol 50% khỏi phôi cá, cho vào mỗi giếng 1ml dung dịch thuốc nhuộm xƣơng, lắc qua đêm ở điều kiện nhiệt độ phòng. Tùy vào số lƣợng mẫu nhuộm, thể tích dung dịch nhuộm phù hợp đƣợc pha từ các thành phần nhƣ sau:
29
Bảng 2.4: Thể tích pha dung dịch thuốc nhuộm xƣơng
thể tích hóa chất 1 ml 2 ml 4 ml 6 ml H2O 260 μl 520 μl 1040 μl 1560 μl Cồn 99% 730 μl 1460 μl 2920 μl 4380 μl Alizarin Red 0,5% 10 μl 20 μl 40 μl 60 μl
Bước 3: Tẩy sắc tố. Sau khi phôi/ấu trùng đã đƣợc nhuộm qua đêm, loại bỏ dung dịch nhuộm xƣơng và rửa nhanh phôi/ấu trùng với 1ml nƣớc cất rồi hút bỏ. Sau đó thêm vào 1ml dung dịch tẩy vào mỗi giếng và để trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch tẩy sắc tố là hỗn hợp gồm H2O2 1,5% và KOH 1% đƣợc pha từ H2O2 3% và KOH 2% theo tỉ lệ 1:1.
Bước 4: Làm sạch. Sau 20 phút tẩy sắc tố, mẫu đƣợc làm sạch những chỗ bắt màu không đặc hiệu bằng dung dịch chứa KOH. Pha dung dịch làm sạch gồm Glycerol 20% và KOH 0,25%, phụ thuộc vào thể tích dung dịch cần, dung dịch có thể đƣợc pha theo bảng dƣới đây:
Bảng 2.5: Thể tích pha dung dịch làm sạch thể tích hóa chất 1 ml 2 ml 4 ml 6 ml H2O 575 μl 1150 μl 2300 μl 3450 μl KOH 10% 25 μl 50 μl 100 μl 150 μl Glycerol 50% 400 μl 800 μl 1600 μl 2400 μl
Bước 5: Rửa. Hút bỏ dung dịch làm sạch và rửa lại bằng 1ml dung dịch Glycerol 50% và KOH 0,25% (mỗi ml Glycerol 50% thêm vào 25μl KOH 10%).
30
Bước 6: Bảo quản. Mẫu đã nhuộm đƣợc lƣu trữ trong dung dịch Glycerol 50% và dung dịch KOH 0,1% (mỗi ml glycerol thêm vào 10μl KOH 10%) ở 4oC.